青岛地区结核分支杆菌吡嗪酰胺耐药基因pnca的检测论文

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1、青岛地区结核分支杆菌吡嗪酰胺耐药基因pncA的检测论文【摘要】目的了解青岛地区结核分支杆菌耐吡嗪酰胺（PZA）分离株pncA基因突变的情况，探讨其与耐PZA之间的关系。方法应用BACTEC460培养系统对76例结核分支杆菌临床分离株进行结核分支杆菌常规培养和药敏检测，聚合酶链反应单链构象多态性（PCRSSCP）技术检测pncA基因的突变。结果76株结核分支杆菌临床分离株均经PCR扩增出结核分支杆菌复合群保守序列IS6110基因片段，69株扩增出pncA基因的特异序列。后者包括：SSCP泳动异常者18株，其中耐药株13株，敏感株5株；SSCP泳动正常者

2、51株，其中耐药株14株，敏感株37株。结论青岛地区结核分支杆菌临床分离株耐PZA主要分子机制之一为pncA基因的突变；PCRSSCP技术能快速准确地检测结核分支杆菌耐PZA基因pncA的突变.freelutationsofpncAgeneinclinicalisolatesofMycobacteriumtuberculosisandtherelationshipbetide(PZA)resistanceinQingdaoarea.MethodsFrom76clinicalisolatesofMycobacteriumtuberculosis,ther

3、outinecultureanddrugsusceptibilitydetection,andthemutationsofpncAgenedetectedbyPCRSSCP.ResultsAmongthe76isolates,44strains.ycobacteriumtuberculosis.PCRSSCPappearstobeapromisingmethodforrapiddetectionofpyrazinamideresistantMycobacteriumtuberculosis,preferabletotheroutinedrugsus

4、ceptibilitytest.［KEYycobacteriumtuberculosis;genes,pncA;BACTEC;polymerasechainreaction;singlestrandconformationpolymorphism近年来,结核病疫情呈现全球性明显回升趋势，其主要原因之一是耐药菌株的产生和播散，尤其是耐多药菌株的涌现。目前对结核分支杆菌耐药分子机制的研究主要集中在各种药物的作用靶位及其相关基因的突变位点上。吡嗪酰胺（PZA）自1949年首次用于肺结核治疗以来，作为第一线抗结核药物应用已有50多年的历史。近几年结核分支杆菌临床

5、分离株对其耐药趋势日渐上升，并且呈现与异烟肼和利福平同时耐药的现象［1］。然而，目前对PZA的作用机制及耐药分子机制尚不清楚。本文应用BACTEC460培养系统进行结核分支杆菌常规培养和药敏检测，聚合酶链反应单链构象多态性技术（PCRSSCP）检测结核分支杆菌pncA基因，旨在了解青岛地区结核分支杆菌耐PZA分离株的pncA基因突变情况，探讨其与耐PZA之间的关系,以建立新的、快速有效的结核分支杆菌药敏试验方法，弥补常规药敏试验的不足。1材料和方法1.1标本来源76例结核分支杆菌临床分离株来自青岛市结核肺病防治研究所2002年1～12月诊治的肺结核病

6、人。其中初治病人60例，复治病人16例；男43例，女33例；年龄21～83岁，平均52岁。1.2主要试剂与仪器结核分支杆菌标准株（H37Rv）购自中国药品生物制品检定所，BACTEC460培养系统试剂购自BECTONDICKINSON公司，dNTP、TaqDNA聚合酶、蛋白酶K、PCRMarker均购自Promega公司，PCR扩增仪为PE公司480型。1.3痰标本的处理及PZA药敏试验根据文献［2］的方法进行菌种鉴定和药敏试验。痰标本经消化、离心，接种至含有C14棕榈酸的12B培养基，37℃培养。第1周上机检测生长指数（GI）值2～3次，以后每周测

7、定1次，至第6周。结果判定标准如下：GI值0～10，培养阴性；GI值11～50，培养阳性；GI值51～100，可进行结核分支杆菌复合群与非结核分支杆菌鉴定；GI值500～800，可进行药物敏感性试验。结核分支杆菌阳性标本一部分提取DNA，-20℃保存备用；另一部分在12B培养基内加入定量PZA进行药敏试验，同时以蒸馏水代替PZA作为对照。按以下标准判定结果：对照组的生长指数(AGI)值测试组的生长指数(△GI)值为敏感；AGI值△GI值为耐药；AGI值＝△GI值为临界。1.4PCR检测结核分支杆菌IS6110及pncA基因1.4.1PCR引物的设计与合成根

8、据GeneBank中结核分支杆菌标准株H37Rv全基因序列,利用D