棉花FAD2-1基因的5’UTR内含子与启动子的顺式作用元件的鉴定及其转录调控作用的研究.pdf

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1、I分类号：密级：学号：2015201215单位代码：10759石河子大学硕士学位论文棉花FAD2-1基因的5’UTR内含子与启动子的顺式作用元件的鉴定及其转录调控作用的研究学位申请人孙亮孙杰教授指导教师刘峰副教授申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称作物遗传育种研究方向作物育种的原理与方法所在学院农学院中国·新疆·石河子2018年5月IIIdentificationandtranscriptionalregulationofcisactingelementsofthe5'UTRintronandpromoterofcottonFAD2-1geneADissert

2、ationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureBySunLiang（Cropgeneticsandbreeding）DissertationSupervisor:Prof.SunJieViceprof.LiuFengMay,2018IIIIV摘要目的：棉花既是最重要的纤维作物，又是重要的油料作物。棉花中，FAD2-1基因是控制种子发育阶段油酸向亚油酸转变的关键基因，其表达水平决定了棉籽油的营养价值与氧化稳

3、定性。对FAD2-1上游序列启动子及5'UTR内含子的关键转录调控元件的识别是理解其表达机制的必要步骤。为了探索FAD2-1表达调控的分子机制和棉籽脂肪酸品质形成的生理学意义，本研究拟分析鉴定出5'UTR内含子与启动子区重要顺式调控元件，进而分析5'UTR内含子与启动子的时空表达特性及对基因表达的影响；研究5'UTR内含子与启动子的协同效应及其在分子育种上的利用价值；为改良棉籽油品质提供科学基础。方法：1.利用5'RACE技术，克隆GhFAD2-1的5'UTR序列，结合棉花基因组序列，进而克隆GhFAD2-15'UTR内含子，并利用PLACE等生物信息学软件对其

4、顺式作用元件进行分析。2.通过生物信息学分析棉花基因组数据库中GhFAD2-1基因信息，克隆获得GhFAD2-1基因5'启动子区序列，并利用PLACE等生物信息学软件对其顺式作用元件进行分析。3.利用Gateway技术构建全长或部分序列缺失的GhFAD2-1的5'序列，驱动GUS基因表达的植物表达载体，转化模式植物拟南芥。4.对转基因植株GUS基因表达进行qRT-PCR分析，对转基因在植株不同组织进行GUS组织化学分析。结果：1.棉花A、D基因组的GhFAD2-15'UTR中各含一内含子序列，全长分别为1103bp、1111bp；GhFAD2-1成熟mRNA的5

5、'UTR为77bp，转录的起点碱基为T；5'UTR内含子两个剪切位点分别AA-GG、CA-GC。作用元件分析表明；该内含子包括一些典型的与光响应相关的作用元件，以及与激素和胁迫因素相关的应答元件等。2.棉花A、D基因组的GhFAD2-15'启动子全长分别为1349bp、1279bp；两者有238个碱基差异。作用元件分析表明；A基因组和D基因组序列中都还具有种子特异的表达元件，以及与激素和胁迫因素相关的应答元件等。3.通过PCR技术扩增GhFAD2-15'序列全长及缺失序列，结合Gateway技术构建成功以下表达载体：pFAD2-12467bp::GUS、pFAD

6、2-12219bp::GUS、pFAD2-12165bp::GUS、pFAD2-11642bp::GUS、pFAD2-11348bp::GUS、pFAD2-11279bp::GUS、pFAD2-12163bp::GUS、pFAD2-11799bp::GUS、pFAD2-11428bp::GUS、pFAD2-11119bp::GUS、pFAD2-11111bp::GUS。通过农杆菌介导的遗传转化，获得各类型转基因拟南芥植株。4.通过缺失启动子的拟南芥转基因植株不同部位染色结果及实时荧光定量PCR的结果发现：在拟南芥种子和胚珠发育时期，驱动GUS基因表达，而其他组织

7、中没有表达，说明该启动子是种子优势表达启动子。同时，我们也证实GhFAD2-15′UTR内含子具有启动子活性。5.从序列缺失驱动GUS基因表达的结果表明，-300element(TGHAAARK)元件对基因的表达量起着重要的调控作用；一定数目的E-Box(CANNTG),SEF4MOTIFGM7S(RTTTTTR),SEF3MOTIFGM(AACCCA),SEF1MOTIF(ATATTTAWW),(CA)nelement(CNAACAC)的累计与基因表达量成正比。结论：棉花GhFAD2-1的5'UTR内含子也发挥了转录增强子功能，其序列含有对所调控基因的转录水平

8、上有重要影响的-300e