胃癌细胞reg ⅰ基因内含子的顺式调控功能

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1、郑州大学硕士学位论文胃癌细胞RegⅠ基因内含子的顺式调控功能姓名：郭林霞申请学位级别：硕士专业：人体解剖与组织胚胎学指导教师：丁一201203郑州大学2010届硕士学位论文中文摘要胃癌细胞SGC7901RegI基因内含子的顺式调控功能硕士研究生郭林霞导师丁一教授郑州大学基础医学院组织胚胎学教研室郑州450001摘要研究背景和目的人类RegI(regeneratinggeneI)基因是1个单拷贝基因，为Peg基因家族的1员，定位于2号染色体，由6个外显子和5个内含子组成。Peg蛋白的功能与抗凋亡因子、急性反应蛋白和神经细胞生长因子相似。近年的研究结果表明，PegI

2、蛋白在胃癌组织中高表达；PegI基因的表达与胃癌的分化程度、浸润性生长以及患者的预后均存在有相关性。胃泌素是由胃和上段小肠粘膜的G细胞分泌的一种多肽类激素，通过与膜上的缩胆囊素．B／促胃液素受体特异性结合而刺激胃酸的分泌。胃泌素与胃上皮细胞的增殖、壁细胞和ECL细胞的数量增加均有非常密切的关系，而且在胃黏膜的恶性变过程中也起着非常重要的作用。前期的研究显示，胃泌素可通过上调RegI基因的表达促进胃癌细胞的生长。但是，胃泌素上调RegI基因表达的分子机制尚不清楚。真核细胞的基因表达由顺式作用元件(cis—actingelement)和反式作用因子(tram．act

3、ingfactor)相互作用而调控。顺式作用元件通常为非编码序列，可影响自身基因的表达活性。PegI基因内含子是否具有顺式调控功能?胃泌素能否对RegI基因内含子的功能产生效应?前期的研究显示，胃癌细胞PegI基西第2内含子具有顺式调控功能。在此基础上，本研究分别克隆人白细胞RegI基因第郑州大学2010届硕士学位论文中文摘要1、3、4和5内含子，构建荧光素酶报告载体，转染SGC．7901胃癌细胞，检测荧光素酶活性，分析RegI基因第1、3、4和5内含子的顺式调控功能。胃泌素孵育转染荧光素酶报告载体的胃癌细胞系，观察胃泌素对RegI基因第1、3、4和5内含子的顺

4、式调控功能的效应。材料与方法1．构建RegI基因第1、3、4和5内含子的萤光素酶报告载体应用PCR技术从人白细胞分别克隆RegI基因的第1、3、4和5内含子，产物经SacI／KpnI双酶切后，将PegI基因第1、3、4和5内含子片段分别克隆入pbluescriptⅡSK+载体，分别命名为SK．intron1、SK．intron3、SK-intron4和SK．in．on5。再分别亚克隆至萤光素酶报告载体灿3-Basic，构建含PegI基因第1、3、4和5内含子的报告载体，分别命名为pGL3-intron1、pGL3-intron3，pGL3-intron4和pGL

5、3．intron5。重组质粒经SacI／KpnI双酶切及测序鉴定。2．转染培养胃癌细胞系SGC7901。应用脂质体LipofectamineTM2000，分3组进行转染：对照组，无质粒转染；实验对照组，转染pGL3．Basic；实验组，分别转染pGL3·intron1、pGL3-intron3、pGL3一intron4和pGL3-intron5。3．荧光素酶活性检测加入lxl0。7moFL胃泌素孵育12h，提取细胞上清，Glomax荧光检测仪检测各组细胞胃泌素孵育前后荧光素酶活性。4．统计学分析：实验数据均采用SPSS17．0统计软件进行分析。数据以均数士标准差

6、表示，应用单因素方差分析进行组间数据差异比较，以P<0．05为差异有显著性。●士霹皇口爿℃1．构建RegI基因第1、3、4和5内含子萤光素酶报告载体：pGL3-intron1、pOL3-intron3、pGL3-in．on4和pGL3-intron5经Kpnl／Sacl双酶切后，琼脂糖凝胶电泳鉴定，插入片段长度与预期一致。DNA测序显示，其序列与GenBank报道一致，且插入方向正确。2荧光素酶活性检测：pGL3-intron1组、pGL3-intron3组、pGL3．intron4组、Ⅱ尸、郑州大学2010届硕士学位论文中文摘要pGL3-intron5组和pG

7、L3-Basic组荧光素酶活性分别为22t．778-4-33．937、3386．556-a：228．544、4092．889士131．920、1256-J：77．444和185+14．526。实验组pGL3．intron1组与实验对照组无显著性差异(尸>0．05)，其余各组均明显高于实验对照组(尸

8、、1757．667"4-