胃癌细胞中调控NGAL基因表达的关键转录因子鉴定

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1、http://www.paper.edu.cn1胃癌细胞中调控NGAL基因表达的关键转录因子鉴定1,221,21,2321,2袁华敏，许丽艳，常静霞，张发仁，杜则澎，蔡唯佳，吕琢，1李恩民1汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室，汕头(515041)2汕头大学医学院肿瘤病理研究室，广东省免疫病理重点实验室，汕头(515041)3汕头大学理学院生物系，汕头(515063)E-mail：nmli@stu.edu.cn摘要：本文主要探讨了胃癌组织细胞中NGAL基因的表达及其分子调控机制。免疫组织化学染色显示，NGAL蛋白在不同分化程度的胃腺癌中呈阳性表达，而在正常胃腺上皮组织中呈阴性表达

2、；在胃癌细胞系BGC-823和SGC-7901中，NGAL分别呈强阳性和弱阳性表达。双荧光素酶报告基因检测显示，在胃癌细胞BGC-823中NGAL基因启动子区核心调控元件位于转录起始位点上游-110~-79；而进一步的突变和缺失分析确认，其间的-85~-79是转录因子结合的关键位点。生物信息学分析发现，-85~-79区段是AP1转录因子家族成员结合位点。而进一步的RT-PCR发现，BGC-823细胞中有多种AP1家族成员的表达。推测AP1家族成员可能是胃癌细胞中NGAL基因表达的关键转录调控因子。关键词：NGAL，胃癌，转录因子，AP1家族中图分类号：Q784；R735.11.引言N

3、GAL（neutrophilgelatinase—associatedlipocalin）基因蛋白编码产物，即中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白，是1993年Kjeldsen等人在研究中性粒细胞的明胶酶（gelatinaseB，[1]即MMP-9）时首先发现的。十多年来的研究表明，NGAL与炎症、免疫反应、细胞分化、细胞凋亡、组织重构以及多种肿瘤的发生与发展等过程相关；而NGAL基因表达已被当作[2]一种早期的、灵敏的、非损伤性的标记物，用于肾缺血及肾毒性损伤监测。另外在动脉粥样硬化斑块、心肌梗塞以及家族性淀粉样变等组织中，可见NGAL基因表达增高，推测可[3,4]能参与了粥样硬化斑块

4、以及梗塞的心肌组织等的降解重塑过程。最近有研究报道，NGAL[5]基因表达还可以作为氧应激的生物标记。而近年来的一些研究发现，NGAL基因在结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、皮肤癌以及食管癌等肿瘤细胞中表达明显升高，可能参与了癌细胞[6-13]的侵袭移动。胃癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一。据统计,全球每年约有60余万人[14]因胃癌死亡,位居癌症死因的第2位。迄今，NGAL基因在胃癌中是否有表达尚未见报道。另外，有关NGAL基因表达调控方面的研究，主要见于以下几篇报道。首先Numata等人研究发现，在G-CSF诱导骨髓细胞32Dc13（IL3依赖的小鼠骨髓细胞clone3）分化为中[1

5、5]性粒细胞时，转录因子C/EBPα可直接激活NGAL基因表达。Cowland等人研究发现，在Ⅱ型肺泡上皮细胞A549培养液中，加入细胞因子IL－1β可诱导NGAL基因表达上调10倍以上，而启动子区内的NF-κB结合位点及其临近序列被预测为可能是调控NGAL基因表达[16]的关键元件之一。而在此基础上，最近，Cowland等人又进一步研究发现，转录调控因子[17]NF-κBζ在IL-1β上调NGAL基因表达中发挥着辅助作用。为了探讨NGAL基因在胃癌组织细胞中是否表达及其分子调控机制，在本文中，我们首先利用免疫组化和WesternBlotting等技术，检测了NGAL基因在胃腺癌组织

6、以及胃癌细胞系中的表达情况，然后通过联合运用渐进式截短缺失、碱基突变、双荧光素报告基因检测和1本课题得到国家自然科学基金面上项目（30672376,30570849,30370641），中国高等教育博士科研基金项目（20050560002,20050560003）和广东省自然科学基金重点项目（37788,05104541）的资助。-1-http://www.paper.edu.cnRT-PCR等实验方法，结合生物信息学分析等研究确定，在胃癌细胞中，NGAL基因启动子区的核心元件位于-85∼-79位点,而关键转录调控因子可能是AP1家族中的成员。2.材料方法2.1细胞培养胃癌细胞系，B

7、GC-823和SGC-7901，分别在含10%小牛血清的199培养液（Invitrogen公司）和DMEM培养液（Invitrogen公司）中贴壁生长。CO2浓度是5%。培养温度37℃。细胞用含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的消化液消化传代。2.2载体构建将人类NGAL基因5’侧翼调控区不同片段（-1431~+84）分别插入到荧光素酶报告基因载[18]体pGL3-Basic（Promega）中，详细构建过程见参考文献。本实验中选用的重组质粒包括pB