鸡piwill启动子区转录调控元件的初步研究

《鸡piwill启动子区转录调控元件的初步研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、鸡尸加zZJ启动子区转录调控元件的初步研究PreliminaryIdentifyingregulatoryelementsinthePromotorofChickenPiwill本研究由国家自然科学基金(31372297)(31301966)；国家科技部支撑计划(2011BAD28803)资助SupportedbyNationalNaturalScienceFoundation(GrantNo．31372297)(GrantNo．31301966)，NationalScientific&TechnologyPillarProgram(G

2、rantNo．201BAD28803)鸡PiwUl启动子区转录调控元件的初步研究研究生：夏明秀导师：陈国宏教授常国斌教授专业：特种经济动物与饲养中文摘要PIWI(P．element．inducedwimpytestis)是Argonatute家族的一个分支，主要存在于生殖细胞中，对生殖干细胞的维持和精子的发生起着重要的作用。自PIWI在果蝇中发现以来，在小鼠、人等哺乳动物中相继获得证实，其功能研究也随之深入，但有关家禽PIWI功能的研究甚少。前期研究发现Piwill的转录存在时空差异，为探讨其在家禽中的转录调控机制，本研究以狼山鸡为实验

3、动物，根据Piwill启动子序列，将Piwill启动子系列缺失片段插入到pGL3．basic载体，构建系列缺失载体，瞬时转染COS．7和GC．1细胞系，最后通过双荧光素酶报告系统确定Piwill核心启动子区；针对核心启动子区，预测可能存在的转录调控元件，对转录因子结合区域进行定点突变，并构建突变重组质粒，通过双荧光素酶报告系统进一步确定存在的转录因子对启动子的调控作用。提取狼山鸡睾丸组织核蛋白进行EMSA实验，确定转录因子与Piwill的结合。分离狼山鸡PGCs、SSCs、精原细胞，并用秋水仙素处理精原细胞，对四种细胞提取核蛋白并进行凝

4、胶迁移实验。结果表明：1．根据Piwill启动子序列，成功构建了7个系列缺失载体，系列缺失表达载体双荧光素酶报告基因显示：M1．M5系列缺失表达载体在COS．7和GC．1细胞系中都有表达，其中M4系列缺失表达载体在两细胞系中相对荧光素酶活性最高；M6．M7系列缺失表达载体在两个细胞系中基本没有表达；从而表明：．268"-'221区域是Piwill核心启动子区。2．在确定核心启动子基础之上，对核心启动子区可能存在的转录因子结合位点进行定点突变，成功构建了突变重组质粒，双荧光素酶报告基因显示：未突变重组质粒与突变重组质粒在COS．7细胞系和

5、GC．1细胞系中都进行了表达，且前者相对荧光素酶活性明显高于后者，这表明：在此区域内，存在转录因子结合位点，并且对启动子的活性起着重要的调控作用。3．EMSA实验表明：成功设计并标记了探针；凝胶迁移结果表明：转录因子与该DNA序列能够结合；经超凝胶阻滞实验进一步说明：睾丸组织中确实存在转录因子NF．Y，并可以与目的DNA片段特异性结合。4．分离鸡的原始生殖细胞(PGCs)，精原干细胞(SSCs)，精原细胞；用秋水仙素处理精原细胞，四种细胞凝胶迁移实验显示：在四种细胞中都存在转录因子NF．Y，并与Piwill启动子．239／．221区DN

6、A序列结合。积分光度值表明：NF．Y在秋水仙素诱导的精原细胞中较高，其次为精原细胞，SSCs，最后为PGCs。我们推测tPiwill存在家禽的整个精子发生过程中，且在精原细胞向精母细胞的分化过程中起着重要的调控作用。关键字：鸡；Piwill；启动子；转录调控；EMSAPreliminaryIdentifyingregulatoryelementsinthePromotorofchickenlllCPiwill，nI，ZZ』Master：MingxiuXiaSupervisor：Prof．GuohongChenProf．GuobinCha

7、ngMajor：TheRearingofSpecial-typeEconomicAnimalsABSTRACTPIWI(P·-element·-inducedwimpytestis)isabranchoftheArgonatutefamilymainlyexistedingermlines，andplaysanimportantroleingermlinestemcellmaintenanceandspermatogenesis．SincePIWIhasbeenfirstdiscoveredinDrosophila,itsubseque

8、ntlyfoundinmouse，humanandotheranimals，butrelatedstudiesonpoultryhasbeenrarelyreported．Previousstudiesha