β3-肾上腺素受体介导大鼠心肌细胞表达TGFβ1及其作用机制的研究.pdf

《β3-肾上腺素受体介导大鼠心肌细胞表达TGFβ1及其作用机制的研究.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、分类号：R54密级：公开学号：2015202104单位代码：10759石河子大学硕士学位论文β3-肾上腺素受体介导大鼠心肌细胞表达TGFβ1及其作用机制的研究学位申请人徐忠诚指导教师王丽申请学位门类级别医学硕士学科、专业名称内科学研究方向高血压和冠心病的发病机制及防治研究所在学院医学院中国·新疆·石河子2018年06月β3-AdrenoceptorsinduceTGFβ1ExpressioninRatCardiomyocytesanditsMechanismADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoft

2、heRequirementsFortheDegreeofMasterofMedicineByXuZhongchengInternalmedicineDissertationSupervisor:Prof.WangLiJune,2018摘要目的：本研究运用过表达β3-AR的慢病毒感染乳大鼠心肌细胞来模拟心力衰竭时β3-AR的高表达状态，同时给予选择性的β3-AR激动剂和拮抗剂以及β3-AR下游相关信号分子特异性的抑制剂，探讨心力衰竭时β3-AR介导乳大鼠心肌细胞表达TGFβ1的作用机制。方法：体外培养乳大鼠心肌细胞，待心肌细胞完全贴壁后，分别以转染复数（multiplicityofin

3、fection，MOI）5、10、20转染携带绿色荧光蛋白（Greenfluorescentprotein,GFP）的过表达β3-AR慢病毒。慢病毒转染心肌细胞72h后，利用倒置荧光显微镜观察细胞中GFP表达丰度、利用q-PCR检测β3-AR在mRNA水平表达情况，以确定慢病毒转染心肌细胞的最佳转染复数。再用携带过表达β3-AR基因的慢病毒以最适MOI转染心肌细胞48h后，分别给予选择性的β3-AR激动剂和拮抗剂以及相关信号蛋白特异性的抑制剂进行处理。实验分6组：（1）正常对照组：心肌细胞，不加任何干预，正常换液培养72h；（2）阴性对照病毒组：心肌细胞+阴性对照病毒(MOI5)培养

4、72h；（3）过表达β3-AR组：心肌细胞+携带β3-AR的慢病毒(MOI5)培养72h；（4）过表达β3-AR+激动剂组：心肌细胞+携带β-53-AR的慢病毒(MOI5)培养48h+BRL37344(10mol/L)24h；（5）过表达β3-AR+拮抗剂+激动剂组：心肌细胞+携带β3-AR的慢病毒(MOI5)培养48h+SR59230A(10-5mol/L)+BRL37344(10-5mol/L)24h;（6）过表达β3-AR+拮抗剂组：心肌细胞+携带β-53-AR的慢病毒(MOI5)48h+SR59230A(10mol/L)24h。用免疫荧光法鉴定心肌细胞纯度，倒置荧光显微镜观察

5、过表达β3-AR慢病毒转染组绿色荧光蛋白（GFP）表达，q-PCR、ELISA和蛋白质免疫印迹法（WesternBlot）分别检测β3-AR、TGFβ1、c-Jun、p-c-Jun、JNK、p-JNK等的表达。结果：（1）乳大鼠心肌细胞鉴定：免疫荧光法鉴定心肌细胞，分离培养的心肌细胞纯度可达90%以上。（2）慢病毒转染效果的检测：以不同MOI的慢病毒转染心肌细胞，在倒置荧光显微镜下观察荧光表达丰度，结合q-PCR检测结果发现MOI=5时病毒转染率较为合适。q-PCR检测各组细胞中β3-ARmRNA表达水平，与空病毒转染组相比，过表达β3-AR在MOI为5、10、20时β3-ARmRN

6、A表达均明显增加(5MOIvs.LV-NC,1208±58.88vs.0.5799±0.1697,P<0.01;10MOIvs.LV-NC,1932±35.08vs.0.5799±0.1697,P<0.001;20MOIvs.LV-NC,4290±277.5vs.0.5799±0.1697,P<0.01)，结果说明构建的β3-AR慢病毒可以有效提高乳大鼠心肌细胞中β3-AR的表达。（3）在过表达β3-AR的乳大鼠心肌细胞中分别给予选择性β3-AR激动剂和拮抗剂观察对TGFβ1表达的影响：病毒转染48h后，分别给予选择性的β3-AR激动剂和拮抗剂处I理24h，用q-PCR和ELISA方

7、法检测TGFβ1表达变化。与单纯过表达β3-AR组相比，过表达β3-AR细胞给予β3-AR激动剂组的TGFβ1表达显著增加(LV-Adrb3-BRLvs.LV-Adrb3,2.894±0.1086vs.0.9945±0.0873,P<0.001);而过表达β3-AR细胞先用β3-AR拮抗剂孵育后再给予β3-AR激动剂组则TGFβ1表达明显被抑制(LV-Adrb3-SR-BRLvs.LV-Adrb3-BRL,1.21±0.1278vs.2.894±0.108