Hedgehog通路对非小细胞肺癌细胞侵袭的调控作用研究.pdf

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1、分类号：R3单位代码：10346密级：学号：2015111012044硕士学位论文中文论文题目：Hedgehog通路对非小细胞肺癌细胞侵袭的调控作用研究英文论文题目：TheregulationofHedgehogpathwayoninvasionofnon-smalllungcancercells申请人姓名：张鑫指导教师：王建秋专业名称：人体解剖与组织胚胎学研究方向：分子细胞生物学所在学院：医学院论文提交日期2018年3月TheregulationofHedgehogpathwayoninvasionofnon-smalllungcanc

2、ercellsAuthor’ssignature:Supervisor’ssignature:ExternalReviewers:ExaminingCommitteeChairperson:ExaminingCommitteeMembers:Dateoforaldefence：杭州师范大学硕士学位论文致谢致谢时光荏苒，三年的时光弹指一挥间。回想刚刚走进师大时，仿佛是在昨日。非常庆幸在人生中最美的年华，走进马云老师眼中“未来世界最好的一所大学”，度过一段难忘的时光。感谢我的导师王建秋老师对我的关怀和指导。导师仁爱，正直，作风严谨，为我树立了

3、良好的榜样。感谢导师的耐心与宽容，帮助我成长与进步。感谢刘俊平老师为我们大家提供如此优渥的实验环境。刘老师知识渊博，治学严谨，为人亲和，又有崇高的科研梦想，他一直是我们大家科研路上的引导者，是我们追随的榜样。感谢王立辉老师、李建峰老师、梁颖师姐、王刚师兄在我完成课题过程中给予的耐心指导和热情帮助。感谢我的家人，我的爷爷奶奶，爸爸妈妈，感谢您们一直以来对我无私的爱与关怀。同时感谢林青等好朋友们，感谢你们一直以来的陪伴与支持。你们让我拥有无数个幸福的瞬间，岁月的脚步依然匆匆，但这三年的生活将永生难忘。在此，谨向所有关心和帮助过我的人表示最诚挚

4、的感谢!最后，衷心感谢三年来杭师大医学院及杭师大科技园对我的培养！感谢在百忙之中，抽出宝贵时间，评阅我论文的各位专家评委，在此衷心地说声感谢，谢谢你们！I杭州师范大学硕士学位论文摘要摘要研究目的:本研究通过构建人Hedgehog通路关键分子SMO/GLI1过表达/低表达的非小细胞肺癌细胞株，验证SMO和GLI1对非小细胞肺癌细胞侵袭的调控作用,并通过分析SMO/GLI1对肺癌细胞上皮间质转化(Epithylial-MesenchymalTransition,EMT)的调节作用，初步探讨其调控非小细胞肺癌细胞侵袭的分子机制。研究方法:（1）

5、基于带有HA或Flag标签的质粒pcDNA3.1构建人SMO和GLI1过表达载体，通过脂质体转染H1299和A549细胞，构建SMO/GLI1过表达非小细胞肺癌细胞株；设计并合成靶向人SMO/GLI1的小干扰RNA（siRNA），通过脂质体转染上述两种肺癌细胞，构建基因敲低细胞株。通过荧光定量PCR及蛋白质免疫印迹方法，检测基因及蛋白水平过表达或敲低效果。（2）应用Transwell小室实验，检测SMO和GLI1过表达/敲低对非小细胞肺癌细胞侵袭的影响。将浓度为1mg/ml的基质胶(Matrigel)铺于上室聚碳酸酯膜上，每孔50ul，待

6、胶凝固后接种培养细胞16h后进行固定及DAPI染色，荧光显微镜下每组随机选择5个视野进行拍照，使用ImageJ软件分析穿膜细胞数，以上室细胞穿过基质胶和聚碳酸酯膜的百分数反映细胞的侵袭力。（3）应用Westernblot方法，检测SMO和GLI1过表达的H1299细胞中，EMT标志物E-cadherin、N-cadhenrin和Vimentin的表达情况,分析SMO、GLI1对EMT的调节作用。（4）应用SPSS16.0统计学软件进行数据分析。数据采用独立样本t检验分析。P值≤0.05为显著性差异标准，P值≤0.01为极为显著性差异标准。

7、所有实验均为独立重复三次。II杭州师范大学硕士学位论文摘要研究结果:（1）酶切鉴定及测序结果表明，成功构建SMO、GLI1过表达载体p3xHA-SMO和p3xFlag-GLI1。荧光定量PCR和Westernblot结果显示，转染过表达载体或siRNA显著提高/降低了SMO/GLI1在非小细胞肺癌细胞H1299和A549中的表达，其中在mRNA水平，与对照组相比，转染过表达载体的H1299/A549细胞，SMO表达分别为对照组的2.927倍（P=0.00041）和2.790倍（P=0.0045），GLI1表达分别为对照组的3.446倍（P

8、=0.00049）和2.660倍（P=0.0036）；转染siRNA的H1299/A549细胞，SMO表达分别降低98%（P=0.0211）和53.3%（P=0.0098），GLI1表达分别降