pdf - 中国野生华东葡萄抗霜霉病抑制消减文库构建及初步分析

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1、中国农业科学2009,42(3):960-966ScientiaAgriculturaSinicadoi:10.3864/j.issn.0578-1752.2009.03.026中国野生华东葡萄抗霜霉病抑制消减文库构建及初步分析张建文，王跃进，朱自果，王沛雅，张朝红（西北农林科技大学园艺学院/农业部西北园艺植物种质资源及遗传改良重点开放实验室/陕西省农业分子生物学重点实验室，陕西杨凌712100）摘要：【目的】分离和获得中国野生华东葡萄抗霜霉病相关基因片段的EST序列。【方法】以高抗霜霉病的中国野生华东葡萄（V.pseudoreticulata）白河-35-1株系为材料，以田间接种葡萄霜

2、霉菌的幼嫩叶片为处理，以田间自然生长的未接种幼嫩叶片为对照，分别提取RNA，采用抑制消减杂交技术构建抗霜霉病基因的消减正交和反交两个文库，在文库中，选择3个EST序列，用半定量PT-PCR检验构建文库中EST片段的表达情况。【结果】构建的文库中EST片段的大小在150～900bp，经筛选文库，得到正交库有效的ESTs85条，反交库ESTs29条,所获序列经过BLASTn和BLASTx网上序列比对，其中有78条ESTs与GenBank中其它植物相关基因序列有较高的同源性，31条为未知功能序列，已登录GenBank114条ESTs,登录号:FG106789-FG106902。进一步利用半定量

3、RT-PCR对文库中3个基因的表达情况进行了分析，证明这些EST序列是可以表达的。【结论】经初步分析这些序列的功能，涉及抗病信号传导、能量代谢、蛋白质代谢、核酸代谢、光合作用及膜运输和代谢等方面，其中获得与抗病直接相关的ESTs23条，下一步是通过对获得的EST序列进行末端快速分析（RACE）技术，获得抗霜霉病基因全长序列，并进行原核和真核表达研究验证基因全长序列功能，为研究葡萄抗霜霉病的基因提供依据。关键词：中国野生葡萄；抑制消减杂交；霜霉病；EST序列ConstructionandPreliminaryAnalysisoftheSSHLibraryofChineseWildVitis

4、pseudoretioulataResistancetoDownyMildewZHANGJian-wen,WANGYue-jin,ZHUZi-guo,WANGPei-ya,ZHANGChao-hong(KeyLaboratoryofHorticulturalPlantGermplasmResourcesandGeneticImprovementinNorthwestChinaofMinistryofAgricultureofthePeople’sRepublicofChina/KeyLaboratoryforMolecularBiologyofAgricultureofShaanxiPr

5、ovinceofthePeople’sRepublicofChina/CollegeofHorticulture,NorthwestScienceandTechnologyUniversityofAgricultureandForestry,Yangling712100,Shaanxi)Abstract:【Objective】Isolatingdisease-resistanceESTsagainstdownymildewfromChinesewildVitispseudoretioulataBaihe-35-1.【Method】Toobtainadifferentiallyexpres

6、sedgeneslibrary,aforward-suppressionsubtractivehybridizationlibraryandareverse-suppressionsubtractivehybridizationlibrarywereconstructed.TheyounggrapeleaveswasinoculatedwithPlasmoparaviticolaasthetreatedmaterials,andtheuntreatedleaveswereusedascontrolmaterials.ESTsfromthelibraryweresequenced.Thre

7、eESTswasanalizedwiththeSemi-QuantitativeRT-PCR.【Result】Theinsertedsegmentswere150-900bpinlength.Altogether85forwardSSHlibraryESTsand29reverseSSHlibraryESTswereobtained.BLASTnandBLASTxanalysisrevealedthat78ESTshavehighh