花椰菜抗黑腐病消减cDNA文库的构建和分析

《花椰菜抗黑腐病消减cDNA文库的构建和分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、第43卷第2期南开大学学报(自然科学版)Vo1．43N_O22010年4月ActaScientiarumNaturaliumUniversitatisNankaiensisApr．2010文章编号：0465—7942(2010)02—0015—08花椰菜抗黑腐病消减eDNA文库的构建和分析江汉民，郝擘，于雪梅，李爱，王春国，孙德岭。，宋文芹(1．南开大学生命科学学院，天津300071；2．天津科润蔬菜研究所，天津300384)摘要：为全面探索花椰菜抗黑腐病的机理，以花椰菜抗黑腐病近等基因系C71

2、2(抗病系)和C731(感病系)为试验材料，构建了一个C712受黑腐病菌诱导表达的正向消减eDNA文库，文库共包含1476个阳性克隆．经斑点杂交筛选后选择了280个阳性克隆进行测序，获得266条通读ESTs．将获得的ESTs去除载体和接头序列以及重复序列后，共得到202条单一序列．利用NCBI的BlastX软件对所得序列进行蛋白序列同源性比对，结果显示，182条序列在蛋白数据库中可以找到同源序列，主要涉及物质及能量代谢、信号传导、转录调控、苯丙氨酸代谢途径及防卫反应等方面．2O个ESTs在Gen

3、Bank中没有查到对应的同源序列，可能是新基因．eDNA文库的构建为进一步研究花椰菜抗黑腐病相关基因及抗病的分子机制奠定了基础．关键词：花椰菜(Brassicaoleraceawar．botrytis)；黑腐病；cDNA文库；抑制性消减杂交中图分类号：Q75文献标识码：A0引言花椰菜(Brassicaoleraceavar．botrytis)是十字花科芸薹属甘蓝的一个变种，具有较高的营养价值和一定的抗癌功效，深受人们的喜爱，近年来在我国的种植面积越来越大，但随着菜田复种指数的提高和生态条件的改变

4、，由野油菜黄单胞杆菌(Xanthomonascampetrispv．campetris，Xcc)引起的黑腐病的发病率越来越高，为害日趋严重，直接影响花椰菜花球的产量和品质，成为生产上迫切需要解决的问题．研究花椰菜抗黑腐病的机制，寻找抗病育种新方法是解决此问题的有效途径．抑制性消减杂交技术(suppressionsub—tractivehybridization，SSH)是一种快速有效分离差异表达基因的方法，对高、低丰度的差异表达基因均能有效分离川．以抗黑腐病的花椰菜C712及其感病的近等基因系(

5、near—isogeniclines，NILs)C731为材料，利用SSH技术富集在Xcc侵染后抗黑腐病品系中差异表达的基因，构建ssHcDNA文库．通过基因功能分析，初步了解抗病花椰菜在与Xcc的互作中涉及的信号传导途径及抗病相关基因表达的种类、数量以及功能，为进一步认识花椰菜抗黑腐病的机制，挖掘和利用花椰菜重要抗病基因奠定基础．1材料与方法1．1材料所采用的植物材料为一对花椰菜抗黑腐病的NILsC731和C712品系，其中C731为感病系作为回归亲本，C712是供体亲本C5与C731杂交后得

6、到的抗性植株，并与C731回交6代得到的抗病系(BCeFz)．所用致病菌为野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampetrispv．campetris，Xcc)，以上材料由天津科润蔬菜研究所提供．1．2方法1．2．1材料的处理：供试材料的种子在5O。C水中处理10min，然后播种于装有灭菌土的营养钵内，置于温室中．待植株长到4片叶时，对植株进行处理．致病菌的接种及样品的采集参照文献[2]进行．收稿日期：2009—02—18基金项目：国家973计划前期研究专项(2007CB116202)作者简

7、介：江汉民(1981一)，男，山东青州人，博士研究生·16·南开大学学报(自然科学版)第43卷1．2．2叶片总RNA的提取与mRNA的分离、纯化：采用Trizol法分别提取抗感病材料胁迫后的总RNA．mRNA的分离纯化依照PolyATractmRNAIsolationSystemⅢ(Promega，USA)的方法进行．纯化后的mRNA调整浓度为0．5g／L，作为构建SSH文库的起始材料．1．2．3抑制性消减杂交：mRNA的反转录和抑制性消减杂交具体操作参照Clontech的PCR—SelectT

8、McDNASubtractionKits(Clontech，USA)的方法进行，以抗性材料的cDNA为Tester，感病材料的cDNA为Driver．1．2．4消减cDNA文库的构建：将消减杂交第二轮PCR扩增产物进行纯化，按照pGEM—Teasy(Promega，usA)载体试剂盒提供的方法将PCR产物与载体进行连接．连接产物转化E．coli感受态细胞JM109，并涂于含Amp／X—gal／IPTG的LB固体培养基上，37C培养过夜．1．2．5阳性克隆的检测：挑取转化平板上的白色菌落，在含Am