对虾病原检测基因芯片的设计与初步研制

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1、上海水产大学硕士学位论文对虾病原检测基因芯片的设计与初步研制姓名：许拉申请学位级别：硕士专业：临床兽医指导教师：黄倢20070401上海水产大学硕士学位论文对虾病原检测基因芯片的设计与初步研制摘要随着对虾养殖业的蓬勃发展，其病害也日益严重，对虾病害种类越来越多。病毒、细菌、立克次氏体、真菌等多种病原都能感染对虾，据不完全统计，目前己发现50多种能感染对虾的病原，引起养殖对虾发病死亡，并且往往不是单一病原感染，病毒感染不仅常伴有细菌，而且可能是多种病毒同时感染。为此建立高通量、高速度、高灵敏度的对虾病原微生物检测技术显得格外重要．

2、本文分析筛选了对虾病原核酸序列后，设计和初步研制了能同时检测多种对虾病原的基因芯片技术。根据Lightner蓝皮书和我国养殖对虾的主要病害，选择对虾的9种病毒、6种细菌、1种真菌和1种立克次氏体为研究对象，在NCBI中分别检索他们的核酸序列，进行BLAST搜索比对，Omiga软件Alignment多重比对，找出各种病原核酸序列的保守区和特异区序列，将筛选确定的各条序列，同时导入到微阵列(microarray)专门的引物和探针设计软件AllelelD3．0，根据引物和探针设计原则，在同一个任务下批量设计出退火温度等各项参数十分相似

3、，扩增片段长度为200--500bp的引物。再根据扩增片段序列，设计长度为5Top的寡核苷酸探针。将设计好的引物和探针再通过BLAST搜索筛选确定其特异性后，由生物公司合成。本研究针对选择的研究对象，共设计了43对引物和43条相对应的寡核菅酸探针。其中包括以宿主对虾序列为模板设计的引物和探针，用来作为阳性对照。本文先针对部分引物进行了特异性验证实验，所采用的9对特异性引物，分别以含有WSSV、mmⅣ、副溶血弧菌、仓Ⅱ伤弧菌、哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌DNA为模板，均能特异性的PCR扩增出与实验设计相符的产物，同时验证了用来作为检测D

4、NA病原的阳性对照。通过建立一步法RT-PCR方法，也验证了为检测RNA病毒的阳性对照。之后，采用同步PCR方法和一步法RT-PCR方法对各个目标序列进行地高辛标记，并测定标记浓度为80Il∥Ill_一100Il∥山．对虾病原检测基因芯片的设计与初步研制将合成后的探针按照设定的位置分布用手动点样仪点在带正电的尼龙膜上，经紫外交联后固定在膜上组成寡核苷酸膜芯片。将DIG标记的扩增产物与膜芯片杂交实验中，首先验证了芯片上的寡核苷酸探针的杂交的特异性，无交叉杂交反应。之后设计了芯片上寡核苷酸探针的浓度梯度，与芯片杂交的DIG标记产物浓

5、度梯度以及杂交时间梯度实验，进行芯片杂交灵敏度的摸索和杂交条件优化。结果显示：芯片上的寡核苷酸浓度为201maol／L即能与DIG标记产物发生明显的阳性显色反应；芯片能检测到16ng／ltl浓度的DIG标记产物，推算芯片的能检测到60pg对虾病原DNA和80pg的病原RNA；杂交时间只需2h。采用膜芯片检测实验室保存的发病对虾样品，在2006年保样品中检测出WSSV、IHHNV、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌；在2004年的样品中检测出WSSV和创伤弧菌。并且检测出感染2006年样品WSSV核酸序列存在13Kb的大缺失变异区

6、，而2004年样品中不存在这个变异区。关键词：对虾，病原，基因芯片，设计，杂交，P(mⅡ上海水产大学硕士学位论文Tentativedesignandappficationofmembranegene-chipfordetectionpathogeninpenaeidshrimpABSTRACTWiththeshrimpaquacultureindustryflourishdevelopment，thepenaeidshrimpdiseaseshavecausedseveredamagetoshrimpculture．Accord

7、ingtoincompletestatistics，morethan50pathogenshavebeenfoundininfectedshrimp，andoftenisnotasingleinfection,whileviralinfectionaccompaniednotonlybacteria,butmanyvirusmaybeinfectedinshrimp．Sotheestablishmentofhighthroughput,hi曲speedandIli曲sensitivitydetectiontechnologyfo

8、rshrimppathogenicmicroorganismsisparticularlyimportant．Inthispaper,after蠲aly《sandfiltrationshrimppathogenicnucleotidesequence，desig