海水养殖动物部分病原检测基因芯片的初步设计

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1、中国海洋大学硕士学位论文海水养殖动物部分病原检测基因芯片的初步设计姓名：荆晓艳申请学位级别：硕士专业：细胞生物学指导教师：黄倢;张士璀20090609海水养殖动物部分病原检测基因芯片的初步设计摘要病害严重威胁海水养殖业的可持续发展，如何寻求一种有效的途径来缓解病害给养殖业带来的危害与损失，一直是人们所关注的问题。现有的病原检测技术局限性大、效率低、系统性差，急需一种海水养殖动物疾病高通量检测手段进行策略上的改进，打破技术瓶颈。随着水产动物病原基础信息数据的日渐丰富，水产动物疾病诊断技术的发展趋势不可避免地向着高通量技术方向跨越。本论文根据“曲恤er蓝皮书、国际兽疫局(OⅢ)水生动物疾病

2、名录、亚太水产养殖中心网络(NAcA)水生动物疾病名录等，选择海水养殖鲽形目鱼类、鲈形目鱼类、对虾类和双壳贝类等宿主的主要病毒、真菌、原生动物等几十种病原微生物作为研究对象，包括14类鱼病毒、14类对虾病毒、鱼立克次氏体、3类真菌以及8类原生动物。针对这些研究对象，在GenbaIlk中共检索收集了27969条相关基因序列，包括海水养殖动物的病原序列2686l条，质控系统所需序列1108条。把在Genbank中分别检索到病原微生物的核酸序列，进行BLAST搜索比对，Omiga软件砧ignm毛nt多重比对，找出各种病原核酸序列的保守区和特异区序列，将筛选确定的各条序列按照宿主的不同，分3类

3、同时导入到微阵列专业的引物和探针设计软件灿leleD6．O中，根据引物和探针设计原则，在同一个任务下批量设计出退火温度等各项参数十分相似，扩增片段长度为200～500bp的引物。再根据扩增片段序列，设计长度为57bp的寡核苷酸探针。将设计好的探针再全部导入Omiga软件进行比对，确定探针之间最多不超过四个连续碱基相同，而且位置处于引物扩增区，与引物没有结合位点，然后交由上海生工合成。本研究中针对选择的研究对象，共设计了检测鱼类病原包括备选引物和探针在内的3l对引物和31条相对应的寡核苷酸探针，检测对虾类病原的37对引物和37条相对应的寡核苷酸探针，检测双壳贝类病原的8对引物和8条相对应

4、的寡核苷酸探针。另外还有以宿主序列为模板设计的引物和探针；用来组成质控体系中全程监控的阳性内对照，以及由非同源性宿主序列为模板设计的引物和探针，用来组成质控体系中的阳性外对照。根据引物和探针的设计结果，按照病原微生物感染宿主的不同，采用基因芯片的原理，将设计合成后的探针按照预先设计的点阵分布用手动点样仪在尼龙膜上点样，经紫外交联后固定在膜上制备成寡核苷酸膜芯片。病原检测膜芯片分为鱼类病原检测芯片、对虾类病原检测芯片和双壳贝类病原检测芯片。根据实验室保存和课题合作单位提供的鱼类和对虾类的阳性病料，本文先针对部分引物进行了特异性验证实验。在鱼类芯片中，所设计的9对特异性引物，分另0以含有E

5、HNV、LCDV、TRBIV、I．YCIV、ISKNV、RGNNV、ⅡINV、VHSV、口Nv和ⅥⅣ的DNA或cDNA为模板，均能特异性的PCR扩增出与实验设计相符的产物；在对虾类芯片中，所设计的8对特异性引物，分别以含有WSSV、刚HNV和TSV的DNA或cDlNA为模板，均能特异性的PCR扩增出与实验设计相符的产物；同时验证了质控体系中的阳性内对照及阳性外对照引物对。之后，采用同步PCR方法和两步法RT-PCR方法，用基因特异性引物加入地高辛标记的dI兀．P扩增并标记各个目标序列，标记后的PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检查后测定标记产量，并测定标记浓度为10n∥“l—On∥m之间

6、。将DIG标记的扩增产物分别与鱼类病原检测膜芯片和对虾类病原检测膜芯片进行杂交实验，杂交结束后的反应信号用NBT．BC口液显色后进行分析，验证了鱼类病原检测膜芯片上11条寡核苷酸探针的杂交特异性，包括3条质控系统的探针和8条分别检测EHNV、LCDV、TRBⅣ、LYCⅣ、ISKNV、RGNNV、ⅡINV、VHSV、DNV和ⅥW的探针；对虾类病原检测膜芯片上12条寡核苷酸探针，包括4条质控系统的探针和8条分别检测WSSV、珊H1W、TSV病原的探针。之后，采用膜芯片检测人工合成的ISAV和ⅧV基因以及从河北唐山取样的发病对虾样品，又成功验证了鱼类病原检测芯片上ISAV探针和对虾病原检测芯

7、片上ⅧV和HPV探针。本文最后对基因芯片技术应用于海水养殖动物病原检测领域进行了分析和展望，海水养殖动物病原检测芯片必将能快速的、高通量的检测和诊断海水养殖动物疾病，系统的、全面的反映海水养殖动物病害发生的原因和状况，确定有效的预警和防治措施，保障海水养殖业的健康持续发展。关键词：PCR地高辛杂交膜芯片检测II海水养殖动物部分病原检测基因芯片的初步设计PrimarydesignofDNA—Microarrayfordetectionpathog