海水养殖动物病原微生物共检芯片的设计与应用

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1、●谨以此文献给为海水养殖事业而努力奋斗的人们!Ⅲ7㈣6洲8¨¨¨i■■-Ⅲ2㈣8⋯川1蓥茎Y●◆上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注中国科学院海洋研究宋林生研究员主席所张士璀中国海洋大学教授委员中国科学院海洋研究孙黎研究员委员所中国水产科学研究院王清印研究员委员黄海水产研究所中国水产科学研究院李健研究员委员黄海水产研究所中国水产科学研究院张庆利副研究员秘书黄海水产研究所中国水产科学研究院答辩地点答辩日期2010．06．07黄海水产研究所●■上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严

2、谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中己经明确注明和引用的内容外，本论文不包括任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：否教Et期：汐，口年／月，，日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关

3、数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密口，在年解密后适用本版权书本学位论文属于一／不保密怕学位论文作者签名：为应日期：歹吖D年石月，，El指导教师签名日期：纱／缉●海水养殖动物病原微生物共检芯片的设计及应用DesignandAppficationofshareddetectionMicroarrayforAnimalPathogensinMariculture学位论文完成时间：指导教师签字：答辩委员会成员签字：●上海海洋大学硕士学位论文海水养殖动物病原微生物共检芯片的设计及应用摘要细菌性病害是

4、影响水产动物健康养殖业发展的主要因素，人们迫切需要一种快速、稳定、准确、高通量的检测手段，对疾病进行提前预警及诊断。随着基因芯片技术的快速发展及微生物基础信息数据库的日渐完善，将基因芯片技术应用于水产病原菌的检测及海水养殖动物疾病的诊断，是一种需要也是一种发展趋势，这将更加有力于海水养殖业的健康、可持续发展。本论文根据蓝皮书、国际兽疫局(OIE)水生动物疾病名录、亚太水产养殖中心网络(NACA)水生动物疾病名录等，选择海水养殖鲽形目鱼类、鲈形目鱼类、对虾类和双壳贝类等宿主的主要病原性原核微生物：鳗弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、副溶血弧

5、菌、哈维氏弧菌、杀鲑弧菌、河流弧菌、霍乱弧菌(非Ol型)、链球菌、爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、杀鲑气单胞菌、假单胞菌、鲑鱼肾杆菌等作为研究对象，另外又加入费氏弧菌、灿烂弧菌、拟态弧菌、海洋分枝杆菌等四种细菌。针对这些研究对象，利用中外文学数据库资源，检索相关研究性文献，从中汇总出用于病原菌检测的特征基因(管家基因、毒力相关基因等特征基因)308个。从GenBank中检索并存档这些特征基因的部分序列3591条，包括质控系统所需基因的部分序列116条。利用GenBank中在线序列同源性检索工具BLAST，对存档的序列进行检

6、索比对，初步筛选后再经过生物信息学专业分析软件Omiga2．0或Accelrysgene2．5对序列进行多重比对，筛选出各种病原菌每个基因对应核酸信息的保守序列或特异序列，将筛选的代表序列或片段再次进行BLAST回检，最终确定代表序列。将代表序列同时导入到微阵列专业设计软件AllelelD6．0中，根据引物和探针的设计原则，在同一个任务下批量设计出退火温度、序列长度等参数一致的引物，扩增片段长度为200～600bp。截取各个参数相对好及BLAST回检结果较理想的引物的扩增序列，同时导入AilelelD6．0中，同一任务下设计出57

7、bp的寡核苷酸探针。探针同样经过BLAST回检，并确保探针问以及与引物问没有交叉，交由生物工程(上海)有限公司合成，引物5’端标记HEX，探针3’端进行氨基修饰。根据本实验室内保留、分离鉴定的9种海水养殖动物病原菌，分别为鳗弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌(04081801)、费氏弧菌、灿烂弧菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、杀鲑气单胞菌(06112506)，筛选出15对特征基因引●上海海洋大学硕士学位论文物和对应的15条特异性寡核苷酸探针，筛选出细菌16S通用引物16．2引物及对应探针作为杂交阳性内对照，筛选牛的胸腺素(I

8、t原基因ProTa引物及对应探针作为杂交阳性外对照，筛选拟南芥TCPl0基因的探针作为阴性对照，选择WSSVvariableregion带有荧光标记的一段序列作为表面化学质控，构建出病原菌共检基因芯片。以病原菌基因组DNA为模板，用15对特征基因引