鸡常见呼吸道病诊断基因芯片的研制与应用

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2、守此规定。论文作者签名：憨：l鱼必导师签名：鎏磕翅r日期：心。‘．b缩写KNAmp。bpcDNADEPCDMSODNAdNTPDTTEBE．coliEDl'AghIBVI【TVIPTGLBMMGmlnmL英文缩略表英文AvianInfluenzavirusampicillinresistantbasepaircomplementaryDNAdiethylpyrocarbonatedimethylsulfoxidedeoxyribonucleicaciddeoxyribonucleosidetri

3、phosphate1．4*DithiothreitolethidiulnbromideEscherichiacoliEthylenediaminetetra-aceticgramhourInfectiousbronchitisvirusInfectiouslaryngotracheitisIsopropylthio·-B·-D--galactosideluria--bertanimediummolarperliterMycoplasmagallisepticumminutemiUiliter中文

4、禽流感病毒氨苄青霉素抗性碱基对互补DNA焦碳酸二乙酯二甲基亚砜脱氧核糖核酸脱氧三磷酸核苷酸二硫苏糖醇溴化乙锭大肠杆菌乙二胺四乙酸克小时传染性支气管炎病毒传染性喉气管炎病毒异丙醇一B．D．硫代半乳糖LB培养基摩尔／升鸡毒支原体分钟毫升mRNAmessengerRNANCfilterNitrocellulosefilterNDVNewcasttediseaseVirUSODopticaldensityPBSphosphatebufferedsalinePCRpolymerasechainreacti

5、onpHpowerofhydrogenRNasefibonucleaserpmrevolutionsperminuteRT-PCRReversetranscriptionPCRSsecondSDSsodiumdodeeylsulphateSSCstandardsalinecitrateUunitrtgmicrogramlaLmicroliterVvolumeX-gal5-Bromo一4一Chloro·3一Indolyl—B—D-Galactoside信使RNA硝酸纤维膜新域疫病毒光密度磷酸盐缓冲

6、液聚合酶链反应pH值RNA酶每分钟转数反转录PCR秒十二烷基磺酸钠标准柠檬酸盐单位微克微升体积5．溴．4．氯一3吲哚一8．硫代半乳糖苷山东农业大学硕士专业学位论文摘要本研究用分子克隆方法获得新城疫病毒、禽流感病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒与鸡毒支原体各一段高度保守基因片段作为探针，用芯片点样仪点样到硝酸纤维膜上，制备成检测基因芯片；提取样品中的RNA进行反转录和生物素标记后滴加到芯片上进行杂交反应，对杂交结果进行扫描分析，可同吐对上述五神常见鸡呼吸道疾病做出诊断。本研究共分为以下三

7、部分：‘第一部分鸡常见呼吸遒病诊断基因芯片方法的建立本部分包括基因芯片的设计与制备、靶基因的标记、芯片杂交时间的选择和芯片的效能评价。通过PCR或RT-PCR方法，分别扩增五种瘸原的特异性核酸片断，并分别与pMDl8--T载体连接，连接产物转化大肠杆菌后，通过PCR法和测序法进行了阳性克隆筛选鉴定。凝胶电泳结果表明，阳性克隆在对应位置可看到特异条带；应用BLAST对扩增产物测序结果与被检病毒核酸序列的进行同源比对，证明与各种被检病毒的大部分毒株同源性在95％以上。提取阳性质粒核酸，扩增纯化后作为

8、探针点在硝酸纤维素膜上，80℃烤膜2h，便完成了基因芯片的制备。在芯片的制备过程中，对不同厂家和不同孔径的膜进行了筛选，结果表明0．65I_tm的北化膜遇溶液不变形，点不易扩散。效果好于浙江黄岩的膜，本底好于美国进口膜。针对靶基因的标记尝试了三种核酸标记方法(掺入法、光敏生物素标记法和末端标记法)，试验结果表明用biotin--16一dUTP掺入法进行标记，灵敏度好于光敏生物素标记，特异性好于末端标记。在42℃下对杂交的时间进行了选择，试验表明，最优的杂交时间为lh。通过对lO份阴性样品和20份