ddahadma在类风湿关节炎中的作用及btm-0512治疗机制研究

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1、中图分类号醴鱼2UDC610博士学位论文学校代码!Q§曼三密级公珏DDAH／ADMA在类风湿关节炎中的作用及BTM．0512治疗机制研究RoleofDDAH／ADMApathwayinthepathogenesis一■·-·‘●‘·‘11l■●’olrnellmatoiaartnritisandtllemeCnanlSm0IBTM—·0512therapyinrats作者姓名：学科专业：研究方向：学院(系、所)：指导教师：陈絮蒙药理学免疫药理学中南大学药学院李元建教授论文答辩日期刈7答辩委员会主席；-g鎏厂g一2中南大学2013年5月原创性声

2、明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。作者签名：岱鳖匙日期：丝f墨年』月上日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、

3、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。期：堡垒年』月上日擅±堂焦论塞主塞煎噩第一章DDAH／ADMA在胶原诱发的类风湿关节炎中的作用及机制摘要研究背景类风湿关节炎是最常见的慢性炎症性的自身免疫系统疾病，但其发病机制尚未完全阐明。非对称二甲基精氨酸(asymmetricdimethylarginine，ADMA)是内源性一氧化氮合酶的抑制物，除抑制一氧化氮的生成外，还是一种前致炎因子。二甲基精氨酸．二甲胺水解酶(dimethylarginined

4、imethylaminohydrolase，DDAH)是ADMA的代谢酶。临床研究发现，类风湿关节炎患者血浆中ADMA水平显著升高，且与类风湿关节炎特异性诊断抗体抗瓜氨酸化蛋白抗体呈显著正相关，这提示DDAH／ADMA途径可能参与类风湿关节炎的炎症反应过程。皮质抑素(cortistatin，CST)是新的生长抑素家族成员，具有调节免疫与抗炎作用，是目前研究最多的生长抑素家族成员。研究发现，CST能显著抑制TNF．0t生成，并减轻胶原所致关节肿胀和软骨破坏。本实验将在胶原诱发性关节炎大鼠模型和原代培养的大鼠成纤维样滑膜细胞，研究DDAH／ADM

5、A在胶原诱发的类风湿关节炎中的作用，并探讨DDAH／ADMA的效应是否涉及CST途径。方法采用胶原诱发性关节炎大鼠模型。关节炎指数评分与关节周径及病理评分(苏木精．伊红染色法)以评价组织损伤。收集大鼠血浆用以检测ADMA与炎性因子水平；分离膝关节滑膜与右后踝关节用以检测滑膜组织炎性因子及DDAH与CST的表达。胶原酶消化法分离大鼠成纤维样滑膜细胞，原代培养，分别收集细胞与细胞上清液。酶联免疫吸附法检测血浆与细胞上清液TNF．Ⅸ、IL．1p及IL-6水平，高效液相色谱检测血浆与细胞上清液ADMA水平。荧光实时定量PCR检测滑膜与细胞TNF．仅、

6、IL．1p、IL．6、DDAH-1、DDAH．2及CSTmRNA表达。免疫组织化学法检测滑膜DDAH-2与CST蛋白表达。蛋白质印迹法检测细胞DDAH-1与DDAH．2蛋白表达。免疫细胞荧光法检测细胞CST表达。利用GV230工具载体建立过表达DDAH-2与过表达CST的原代大鼠成纤维样滑膜细胞，以分析DDAH-2与CST的相互作用关系。结果胶原诱发性关节炎大鼠较正常大鼠关节红肿变形，关节炎指数及病理评分显著高于正常对照组，软骨及骨质破环，血浆和滑膜组织中TNF．0【、IL．113及IL．6水平均显著升高，滑膜组织DDAH-2表达显著下调，而

7、滑膜组织DDAH-1表达和血浆ADMA水平则没有明显变化。CST在胶原诱发性关节炎大鼠滑膜组织中的表达也显著下调。在原代培养的大鼠成纤维样滑膜细胞，TNF．0【可时间依赖性升高细胞IL．1p、IL．6及ADMA水平并降低DDAH-2与CST表达，但对DDAH-1表达无明显作用。外源性ADMA处理也可时间与剂量依赖性促进大鼠成纤维样滑膜细胞分泌IL．1p、IL．6，并下调CST表达。过表达DDAH-2能显著抑制TNF．a促IL．1p、IL．6分泌与下调CST表达的作用。过表111达CST也可以显著抑制TNF．伐促IL．1p、IL．6分泌的作用，

8、但不影响ADMA水平与DDAH-2表达。结论DDAH／ADMA途径在胶原诱发的类风湿关节炎炎症反应中起重要作用；参与炎症反应的DDAH亚型为DDAH．2而非DDAH