cebps诱饵寡核苷酸对脓毒症小鼠多器官损伤的保护作用及机制研究

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1、万方数据中图分类号UDC博士学位论文学校代码10533C／EBPs诱饵寡核苷酸对脓毒症小鼠多器官损伤的保护作用及机制研究ProtectiveeffectofC／EBPsdecoyoligodeoxynucleotidesonmultipleorgandamagein●⋯●1‘-●omicewithsepSISanditsmeCnanlSm作者姓名：高敏学科专业：病理学与病理生理学研究方向：脓毒症与多器官损伤学院(系、所)：基础医学院指导教师：肖献忠教授中南大学二O一三年十一月万方数据学位论文原创性声明本人郑

2、重声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。作者签名：名敏日期：jL年旦月皇日学位论文版权使用授权书本学位论文作者和指导教师完全了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构

3、送交学位论文的复印件和电子版；本人允许本学位论文被查阅和借阅；学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其它手段保存和汇编本学位论文。保密论文待解密后适应本声明。作者签名：、南乌支日期：卫年』月旦日导师签日期：日万方数据本课题受以下基金资助·国家自然科学基金项目：内毒素血症小鼠生物标志物的筛选及诊断与预测数学模型的建立批准号：81071594·湖南省研究生科研创新项目：内毒素血症小鼠生物标志物的筛选批准号：CX20118045Ⅱ万方数据C／EBPs诱饵寡核苷酸对脓毒症小

4、鼠多器官损伤的保护作用及机制研究摘要背景及目的：脓毒症(sepsis)是感染导致的全身炎症反应综合征(systeminflammatoryresponsesyndrome，SIRS)，是重症监护病房(ICU)内常见并发症及首要死亡原因。脓毒症治疗花费高，医疗资源消耗大，对人类健康和社会经济造成巨大威胁。CCAAT增强子结合蛋白(CCAATenhancerbindingprotein，C／EBPs)是一组属于碱性亮氨酸拉链(basicregionleucinezipper,bZIP)家族的转录调控因子，目前已

5、发现6个成员：0【、p、小6、￡和‘。其中成员a、p、6及￡在各种炎症性疾病急性期反应中发挥关键作用，且作为转录因子有着共同的特异性识别序列RTTGCGYAAy(其中R为A或G，Y为C或T)。因此，为了寻找新的脓毒症防治靶点，本研究采用转录因子诱饵策略(transcriptionfactordecoystrategy,TFDs)体外合成针对转录因子C／EBPs的哑铃形诱饵寡脱氧核苷酸(C／EBPsdecoyODNs)，然后探讨了C／EBPsdecoyODNs对脓毒症的影响及其机制。方法：1)体外实验：先采用

6、免疫印迹分析(westernblot，WB)及凝胶滞留实验(electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)观察LPS(1vgdmL)刺激下RAW264．7细胞内C／EBPs蛋白表达水平及DNA结合活性的变化以期验证C／EBPs在炎症反应中发挥重要作用；然后设计合成针对转录因子C／EBPs的特异性哑铃形decoyODNs及用于对照的突变寡脱氧核苷酸(C／EBPsmutantODNs)，在采用电泳及EMSA验证ODNs的合成符合设计要求后用阳离子转染试齐UTurboFect将荧光

7、基团FAM标记的ODNs转染入RAW264．7细胞，分别采用流式细胞术检测ODNs转染效率；Hoechst染核后经荧光显微镜观察decoyODNs在细胞内的分布；alamarBlue实验观察ODNs的细胞毒性；WB观察其对C／EBPs蛋白表达水平的影响；采用ELISA检测C／EBPsdecoyODNs对LPS(1pg／mL)刺激下RAW264．7细胞上清中细胞因子TNF．0【，IL．1B及IL．6的表达影响；采用Real．timePCR检测C／EBPsdecoyODNs对LPS(1gtg／mL)刺激下RAW

8、264．7细胞内多个C／EBPs炎症相关靶基因的表达影响。2)体内试验：采用盲肠结扎穿刺(CLP)制备脓毒症III万方数据小鼠模型，经量效实验和时效实验观察C／EBPsdecoyODNs对脓毒症小鼠存活率的影响；尾静脉注射FAM标记的C／EBPsdecoyODNs6h及24h后检测组织匀浆上清荧光密度观察decoyODNs的器官分布及停留情况；然后通过检测反应多器官损伤的血清生化指标及多器官光镜下形态学变化观察C