高保真dna聚合酶分子开关用于tp53基因热点突变的检测

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1、SOOCHOWUNIVERSITY硕士学位论文论文题目高保真DNA聚合酶分子开关用于TP53基因热点突变的检测研究生姓名寇晓进指导教师姓名李凯专业名称药理学研究方向分子诊断论文提交日期2013年5月高保真DNA聚合酶分子开关用于TP53基因热点突变的检测中文提要中文提要目的：利用硫化修饰的碱基特异性引物偶联高保真酶所构成的突变敏感性分子“开/关”系统检测TP53基因的热点突变（G175A，G245A，C248T，G249T，G273A和C282T）。同时结合实时荧光定量PCR技术，通过扩增曲线和熔解曲线准确、快速地判断6个热点突变的存在与否，并对突变进行半定量分析。方法：将包含上述六个密

2、码子的PCR产物克隆至pMD19-T载体，并转化至DH5α感受态细胞，通过LB/Amp/IPTG/X-gal平板筛选出白色克隆，利用载体通用引物和PCR引物对其进行菌液PCR初步鉴定，并通过测序分析进行确证，得到TP53基因的野生模板质粒。采用重叠延伸PCR技术，对所需位置的碱基进行定点突变，分别得到6种突变基因型PCR产物，克隆并用同样方法筛选出阳性克隆，经测序确证得到分别含有TP53基因G175A，G245A，C248T，G249T，G273A和C282T的突变质粒模板。然后以这六个突变位点为检测靶点，分别设计3’末端与野生型基因位点或突变型基因位点配对的硫化修饰引物；利用高保真DN

3、A聚合酶接到突变敏感性分子开关，对TP53基因野生型质粒模板和6种突变型质粒模板进行检测，并通过凝胶成像系统进行分析；采集正常人以及肿瘤患者的组织或血样标本，通过临床样本对检测方法进行评估，并对肿瘤样本进行TP53基因6个热点突变的筛查。结合荧光定量PCR技术，评估高保真酶介导的敏感性分子开关在荧光定量PCR中的敏感性和相关性。结果：通过在不同的反应体系中分别对六个热点突变进行检测。结果显示，在高保真DNA聚合酶介导的PCR反应体系中，仅完全配对引物得以延伸，不完全配对引物则不被延伸，即3’端硫化修饰突变检测引物仅对配对的突变模板有扩增产物，对野生模板无扩增产物。运用该检测方法对20例临

4、床健康志愿者和29例癌症患者的组织及血样做检测，未发现TP53基因的G175A，G245A，C248T，G249T，G273A和C282T突变，检测结果与测序结果一致。由此可以看出，突变敏感分子开关对体细胞突变的检测具有很好的特异性及敏感性。结论：本研究充分利用高保真DNA聚合酶偶联硫化引物构成的突变敏感性分子开关成功开发出了可准确检出TP53基因175，245，248，249，273和282号密I中文提要高保真DNA聚合酶分子开关用于TP53基因热点突变的检测码子单碱基突变的新方法，并通过对不同类型的临床标本的检测，验证了其高敏感性和高效性。该技术除可用于检测血液基因组DNA的遗传性突

5、变外，还可以检测血中游离DNA中存在的微量体细胞基因突变。该技术在TP53基因筛查中具有较大的潜在应用价值，能够对含有上述TP53基因的六个突变位点的某一具体癌症进行癌前诊断，产前诊断，预防和预后检测。关键词：高保真DNA聚合酶；突变敏感性分子开关；硫化修饰；TP53基因作者：寇晓进指导教师：李凯II高保真DNA聚合酶分子开关用于TP53基因特点突变的检测英文提要Amutation-sensitiveswitchbasedassaysforhotspotmutationsofTP53geneAbstractObjective:TodetectthehotspotmutationsofTP

6、53gene(G175A,G245A,C248T,G249T,G273AandC282T)usingtheproofreadingpolymerase-mediatedmutation-sensitive"on/off"switch.Withtheuseofreal-timePCR,thesixhotspotmutationscanbeendetectedbymeltingcurveandamplificationcurvequicklyandaccurately.Methods:TheDNAfragmentscontainingthesixhotspotmutationsofTP53g

7、enewereamplifiedandthePCRproductswereclonedintopMD19-TvectorfortransformationtoE.coliDH5αcompetentcellsforpreparingwildtypevector.Themutationtemplatesharboringthecorrespondingmutanttemplateswereobtainedbyoverlappingext