基因突变敏感性分子开关检测β地中海贫血基因突变

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1、178实用医学杂志2012年第28卷第2期基因突变敏感性分子开关检测l3地中海贫血基因突变兰芬郭紫芬邓坤龙廖端芳李凯摘要目的：采用高保真DNA聚合酶介导的基因突变敏感性分子开关准确、快速检测B地中海贫血。方法：首先提取正常人血液基因组DNA，根据已知p珠蛋白基因热点突变CD41—42、IVS2．654区域序列，分别设计突变序列扩增引物，利用低保真酶进行引物延伸反应，将其PCR产物克隆到pMD19一T载体，得到B地中海贫血常见的两个突变位点的基因突变克隆：CD41．42、IVs2—654，然后以这两个突变位点为检测靶点，分别设计3末端与野生型基因位点或突变基因位点配对的引物．硫化磷

2、酸修饰3末端并偶联高保真DNA聚合酶构成的基因突变敏感性分子开关．对含有相应突变的阳性质粒模板及正常人基因组DNA模板进行引物延伸反应，并通过凝胶成像系统对其进行分析。结果：当引物与模板完全配对时，引物被延伸，有PCR产物；当引物与模板不完全配对时．引物不被延伸．无PCR产物。结论：高保真DNA聚合酶介导的基因突变敏感性分子开关能准确、快速筛查0地中海贫血CD41—42、IVS2654突变，提示其在单基因遗传病的诊断中具有广阔的应用前景。关键词B地中海贫血；高保真聚合酶；硫化修饰引物DetectionofthegenemutationsofB-thalassemiabygenem

3、utation-sensitivemolecularswitchLANFen，GUOn，DENGKun—lun，LIA0Duan-fang，LIKai．InstituteofPharmacyandPharmacology，UniversityofSouthChina，Hengyang421001，ChinaCorrespondingauthor：LIKaiE—maiZ：kaili34@yahoo．com．ca【Abstract】0bjectiveTodetect3-thalassemiabytheapproachofgenemutation—sensitivemoleculars

4、witch．MethodsGenomicDNAwasextractedfromnormalblood．AccordingtothesequencesofknownhotspotmutationregionofCD41-42andIVS2-654in13一globingene，themutantsequenceprimerwasdesigned，andthenprimerextensionreactionwasperformedwithlow．fidelityenzyme．andthePCRproductswasclonedintopMD19．Tvector．Twokindsofc

5、lonesofB．thalassemiamutationgene(CD41．42andIVS2．654)wereobtained．Thenthesetwomutationregionwereusedasdetectiontarget，3·terminalprimerwhichwasmatchedwithwildtypeormutationgeneregionwasdesigned，andthe3'-terminalwasmodifiedwithsulfidephosphatetheandlinkedtogenemutation—sensitivemolecularswitchwh

6、ichwasconstructedbyhigh-fidelityDNApolymerase．ThepositiveplasmidtemplateincludingthetargetmutationandnormalgenomicDNAtemplatewereadministeredbyprimerextensionreaction，andwereanalyzedbygel—imaginesystem．ResultWhentheprimerwasfullymatchedwiththetemplate，theprimerwasextended；Whentheprimerwasnotf

7、ullymatchedwiththetemplate，theprimerwasnotextended．ConclusionGenemutation．．sensitivemolecularswitchwhichwasconstructedbyhigh．fidelityDNApolymerasecouldaccuratelyandrapidlyscreenedthemutationofCD41—42andIVS2—654ofB—thalassemia，suggestingthatit