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时间:2019-02-22
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1、分类号密级UDC编号硕士学位论文基因突变敏感性分子开关检测β地中海贫血研究生姓名:兰芬指导教师姓名、职称:李凯教授郭紫芬副教授学科、专业名称:药理学研究方向:分子与心血管药理学2012年5月万方数据原创性声明本人声明,所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了论文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中做了明确的说明。作者签名:日期:年月日关于学位论文使用授权
2、说明本人同意南华大学有关保留、使用学问论文的规定,即:学校有权保留学位论文,允许学位论文被查阅和借阅;学校可以公布学位论文的全部或部分内容,可以采用复印、缩印或其他手段保留学位论文;学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。作者签名:导师签名:日期:年月日万方数据目录(contents)一主要缩略语英文索引………………………………………………1二中文摘要……………………………………………………………2三英文摘要……………………………………………………………4四论文正文前言………………………………………………………………6实验材料……
3、………………………………………………………8实验方法……………………………………………………………9突变载体的构建与测序…………………………………………9分子开关检测突变模板…………………………………………15实验结果……………………………………………………………17讨论…………………………………………………………………27结论…………………………………………………………………29五参考文献……………………………………………………………30六综述…………………………………………………………………33七硕士期间成果…………………………………
4、……………………39八致谢…………………………………………………………………40万方数据主要英文缩略语索引英文缩写英文全称中文全称SNPsingle-nucleotidepolymorphism单核苷酸多态性PfuPfuDNApolymerasePfuDNA聚合酶TaqTaqDNApolymeraseTaqDNA聚合酶PCRpolymerasechainreaction聚合酶链式反应DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸脱氧核糖核苷三磷dNTPDeoxyribonucleotidetriphosphate酸SSCPsi
5、ngle-strandconformationpolymorphism单链构象多态性ASOAllele-specificoligonucleotide等位基因特异性寡核苷酸RDBReversedotblot反向点杂交HPLChigh-performanceliquidchromatograpphy高效液相色谱法Rpmrevolutionsperminute每分钟转数SDSsodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠EDTAethylenediaminetetraaceticacid四乙酸乙二胺1万方数据基因突变敏感性分子开关检
6、测β地中海贫血中文摘要目的:采用高保真DNA聚合酶介导的基因突变敏感性分子开关准确、快速检测β地中海贫血基因突变。方法:首先提取正常人血液基因组DNA,根据已知中国人群β珠蛋白基因热点突变CD41-42、IVS-2nt654、TATAbox-28、CD17、CD71-72及CD26区域序列,分别设计引入突变位点的扩增引物,利用低保真酶进行引物延伸反应,将其PCR产物克隆到pMD19-T载体,得到β地中海贫血常见的六个突变位点的基因突变克隆:CD41-42、IVS-2nt654、TATAbox-28、CD17、CD71-72及CD26。然后
7、以这六个突变位点为检测靶点,分别设计3’末端与野生型基因位点或突变型基因位点配对的引物,硫化磷酸修饰后偶联高保真DNA聚合酶构成基因突变敏感性分子开关。首先在不同体系分别对含有相应突变位点的六个阳性质粒模板及正常人基因组DNA模板进行引物延伸反应,并通过凝胶成像系统对其进行分析;然后在同一体系中同时对含有相应突变位点的六个阳性质粒模板及正常人基因组DNA模板进行引物延伸反应,并通过凝胶成像系统对其进行分析;最后对已知分别含有CD26和TATAbox-28突变位点的病人DNA样本进行检测。结果:在不同反应体系分别对六个热点突变进行检测。结果
8、显示,使用正常人的染色体DNA样本,该方法仅能使野生型等位基因相关引物得以延伸,而突变型等位基因位点特异性引物不能被延伸。反之,使用突变质粒模板,该方法仅能使突变型等位基因位点相关引物得以延伸
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