基因突变敏感型分子开关验测hiv

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1、基因突变敏感型分子开关验测HIV序言HIV-1因其为RNA病毒，具有高突变特性。HIV-1病毒基因突变使药物作用靶点结构发生改变，导致病毒对药物不敏感或敏感性下降。目前已确定了多种类型HIV耐药相关的基因突变，如何准确测定耐药基因突变临床意义重大。目前已有多种方法可以用来判断抗病毒治疗耐药性的发生与否。现有方法均采用血浆病毒基因分析，以确定是否病毒基因的改变导致了抗逆转录病毒治疗的失败。自从目前普遍使用HAART即HIV-1的RT和PR抑制剂的组合，在RT和PR基因的基因突变是最有可能导致艾滋病病毒耐药性。自动DNA循环测序技术是目前进行HIV-1基因分型分析最常用的方法。ViroSeqTM

2、HIV-1病毒基因分型系统（PEAppliedBiosystems）和TrugeneTMHIV-1病毒测试运用一个集成软件算法测试给临床医生提供RT或PR具体哪个基因突变最可能导致耐药。以DNA测序为基础的各种基因方法之间的比较表明RT和PR基因突变具有很高的一致性[1]。新近研究对比了检测RT和PR较小突变不同技术的能力，如果没有更好的技术检测HIV的基因突变，其他的几种技术也有相似的能力。这些技术包括等位基因特异性实时PCR(ASRT),连接酶为基础的寡核苷酸检测（OLA），限制稀释（limitingdilution）RT-PCR（LDRT-PCR）和焦磷酸测序[2]。一些成本低，测试能

3、力有限的分析方法也能有效提供HIV-1耐药的有关信息。例如，使用特定的病毒基因密码子的变化赋予耐药很容易读出条带，但使用这种测试只限制基因突变有相似条带，同样DNA修复酶CleavaseTM分析法可能会发现所有的病毒基因突变,但不能提供基因密码子改变的具体信息[3].其中一种最有效测定HIV-1耐药基因的技术是芯片技术.Affimatrix已经开发了一种特殊基因芯片艾滋病毒PRT探针，可用于检测所有可能RT或PR抑制剂的耐药基因突变，但是，这个技术具有局限性，因其使用的芯片和仪器设备成本高。国际艾滋病协会美国耐药突变组每年更新抗艾滋病毒治疗产生的耐药[4]。一些医生倾向于使用表型艾滋病毒的检

4、测，因为可以直接测量病毒的药物敏感性。此外，表型分析也能确定多药交叉耐药性，目前在美国和比利时Virco病毒学提供这项服务。此外，ViroLogic也提供了一种新的复制能力方法（也称为theViralFitnessassay），可以测量艾滋病毒自我复制能力，提供额外的信息,选择适宜的抗逆转录病毒疗法[3]。TheViralFitness和表型艾滋病毒检测的缺点是费用昂贵并且需要2-4周的周转时间。综上所述，许多这些新方法价格昂贵，而且需要专业技术，所以不能广泛用到实践中。我们采用高保真酶联合引物硫化修饰的分子开关技术进行HIV-1耐药位点突变的检测，免去了DNA测序等操作复杂及花费昂贵的步骤

5、，具有经济、方便、快速的特点。且该分子开关能与琼脂糖凝胶电泳、普通PCR、荧光定量PCR等分子生物学常规仪器相结合，将有利于该技术在大范围推广使用，将有助于及早发现HIV-1耐药突变。分子开关对上述七个位点的识别敏感性大部分可达到101~109拷贝，特异性分别为104~105拷贝，这一特定引物扩增特定模板的特异性在突变与野生序列之间的达到3个或3个以上对数级，能有效早期检测耐药突变。在比较高、低保真聚合酶在引物延伸反应中的差异时发现，高保真聚合酶引发模板依赖性引物延伸反应，对特定设计的引物，当引物与模板不配对时，其引物延伸反应可出现非成熟性的终止。其具体机制为：在引物与模板配对时，两者直接在

6、聚合中心进行引物延伸反应，而引物与模板不配对时，则送到酶解中心进行酶解校正，若不配对引物被及时酶解，则送回聚合中心，继续引物延伸反应，若引物不能被及时校正，则可能引发引物延伸反应的非成熟性终止[5-8]。这一机理维持了DNA聚合反应中合成的终产物的保真度。在进一步研究高保真DNA聚合酶的保真性与该酶3→5外切酶活性的相互关系时，开发出了突变敏感性分子开/关。该分子开关由具有外切酶活性的高保真DNA聚合酶与碱基硫化磷酸修饰后能耐外切酶消化的特异性引物所构成，表现出与模板完全配对的引物能被延伸有产物生成，而不配对引物不能被延伸无产物生成的有或无的二元化效果，满足了对特定位点进行突变分析

7、时非此即彼的二元化辨认[9-12]。本实验拟将高保真聚合酶介导的突变敏感性分子开关联合琼脂糖凝胶电泳，建立在不同反应体系对七个耐药突变进行快速检测的技术平台。我们曾报道，突变敏感性分子开关是指将高保真酶的3外切酶特性与耐外切酶消化的碱基特异性引物相结合，构成了受单碱基变化调控的分子开关[13-15]。与现有的突变检测方法相比，由高保真聚合酶所介导的复合分子开/关，除其特有的高可靠性之外，还具有经济、实用和可应