食源性金黄色葡萄球菌肠毒素基因检测和基因分型研究

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1、河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权利对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则，承担相应的法律责任。j‘。研究生签名：卫啼蝻导师签章：，静纠勤学院鎏每：年月日一一-．⋯*，研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写

2、的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。研究生签名：卫冲楠导师签章：年月日目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．3研究论文食源性金黄色葡萄球菌肠毒素基因检测和基因分型研究—1．￡．—j．o月U舀⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯9结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．15附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯18

3、附表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．27讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．36结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．39参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯39综述金黄色葡萄球菌基因分型方法研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯43致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯55个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯56中文摘要食源性金黄色葡萄球菌肠毒素基因检测和基因分型研究摘要目的：1建立食源性金黄色

4、葡萄球菌14种肠毒素基因的多重PCR检测方法，调查石家庄地区食源性金葡菌中肠毒素基因的分布状况。2设计食源性金葡菌的MLVA分型方法，比较MLST、MLVA、PFGE三种基因分型方法在食源性金葡菌基因多样性研究中的优劣势。方法：l对93株食源性金葡菌进行复苏传代培养，用试剂盒提取基因组DNA；2设计14种肠毒素基因A、B、C、D、E、G、H、J、K、L、M、N、Q、U的PCR引物，通过优化反应条件确定多重PCR反应体系，对石家庄地区分离的93株食源性金葡菌进行肠毒素基因的检测；3参考相关文献，结合网站数据设计金葡菌的MLVA分型方法。应用MLST、MLV

5、A、PFGE三种方法分别对26株食源性金葡菌进行基因分型，对分型结果进行对比分析。结果：l93株食源性金葡菌均成功复苏，提取的基因组DNA浓度和纯度均符合实验需求。2设计的14种肠毒素基因PCR引物除SEE外，均扩增到了目的基因片段，双向测序结果在GeneBank上进行BLAST比对，证实为肠毒素基因的目的片段。3设计优化的多重PCR反应体系能够成功扩增到食源性金葡茵的肠毒素基因目的片段，经检测，93株食源性金葡菌中79株检出含有肠毒素基因，肠毒素基因的检出率为84．95％；其中检出SEA的有55株(59．14％)，SEG32株(34．4l％)，SEM3

6、2株(34．41％)，SEK25株(26．88％)，SEB22株(23．66％)，SEU21株(22．58％)，SEN20株(21．51％)，SEH16株(17．20％)，SEJ15株(16．13％)，SEC14株(15．05％)，SED13株(13．98％)，SEQ13株(13．98％)，SEL7株(7．53％)；此外，57株金葡中文摘要菌(61．29％)被检出同时含有两种或两种以上肠毒素基因，其中有1株检测到同时含有10种肠毒素基因，3株检测到同时含有9种，3株检测到同时含有8种。4MLST分型将26株金葡菌分成8个ST序列型，其中ST59型11株，

7、均来自同一起食物中毒分离获得的菌株；ST5型5株，ST464型3株，ST7型和STl5型各2株；此外还获得了一个新发现的ST序列型，已提交MLST国际数据库进行确认并收录。5设计的MLVA方法具有较好的分型力和可重复性，26株食源性金葡菌经此方法成功分为10个基因型，其中VA05型1l株，均为一起食物中毒中分离的菌株，VA07型4株，VA01型、VA09型和VAl0型各两株，其他各一株。6PFGE分型将26株金葡菌分为9组共13个基因型，其中A组共ll株，均为一起食物中毒中分离的菌株，B组有4个亚型共4株，C组有两个亚型共3株，D组和E组各两株，其他组各

8、一株。结论：l设计的14种肠毒素基因PCR引物以及多重PCR反应体系具有较好的稳