牛乳金黄色葡萄球菌分离株超抗原肠毒素基因分型研究

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1、动物医学进展，２０１４，３５（１２）：１４－１８ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ牛乳金黄色葡萄球菌分离株超抗原肠毒素基因分型研究孙颖１，汤婷婷１，鲍庆晗１，郭海勇１＊，崔京春２＊（１．吉林师范大学生命科学学院，吉林四平１３６０００；２．大连民族学院生命科学学院，辽宁大连１１６６００）摘要：为研究牛乳金黄色葡萄球菌ＳＰ－３分离株携带超抗原肠毒素的基因型，设计合成了金黄色葡萄球菌超抗原肠毒素基因ＳＥＡ－ＳＥＥ及ＴＳＳＴ－１特异性引物，并以其固有基因ｆｅｍＡ和ｆｅｍＢ为阳性对照，以分离菌株ＤＮＡ

2、为模板，经ＰＣＲ扩增菌株携带的毒素基因。结果表明，ＳＰ－３分离株和阳性对照菌株均含有ｆｅｍＡ和ｆｅｍＢ基因，且牛乳分离株携带ｓｅａ、ｓｅｃ、ｓｅｄ和ｔｓｔ－１４种超抗原肠毒素基因，为开展动物源超抗原毒素基因系统分型及有效防控金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎奠定基础。关键词：金黄色葡萄球菌；超抗原；肠毒素；基因分型中图分类号：Ｓ８５２．６１１文献标识码：Ａ文章编号：１００７－５０３８（２０１４）１２－００１４－０５金黄色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）是引效控制金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎奠定基础。起人及动

3、物感染的重要病原菌之一，其中产超抗原１材料与方法毒素的葡萄球菌具有极强的致病性，引起人毒素性１．１材料休克症、化脓症等多种疾病，尤其是耐药菌株（ＭＲ－１．１．１菌株金黄色葡萄球菌标准株ＳＡ）绝大部分可产生超抗原毒素，交叉污染传播而（ＡＴＣＣ１２６００）由大连吉翔农业科技有限公司研究又难以治疗，对人类健康造成了严重威胁；引起奶中心保藏提供；金黄色葡萄球菌８３４株（阳性对照）［１］牛、羊的乳腺炎，给养殖业带来了重大经济损失。由日本北里大学胡东良教授惠赠；金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌能产生多种毒素，主要包括肠毒素分离株

4、ＳＰ－３从患奶牛乳腺炎的乳样中分离，由吉林（ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｓ，ＳＥｓ）、休克综合征毒素－１（ｔｏｘｉｃ－ｓｈｏｃｋ师范大学微生物实验室保存。ｓｙｎｄｒｏｍｅｔｏｘｉｎ－１，ＴＳＳＴ－１）、剥落毒素（ｅｘｆｏｌｉａｔｉｖｅ１．１．２试剂ＤＮＡＭａｒｋｅｒ、ＥｘＴａｑ聚合酶、ｔｏｘｉｎｓ，ＥＴｓ）和杀白细胞素（ｐａｎｔｏｎ－ｖａｌｅｎｔｉｎｅｌｅｕｋｏ－ｄＮＴＰ、琼脂糖等试剂均购自宝生物工程（大连）有限ｃｉｄｉｎ，ＰＶＬ），其中肠毒素是引起多种疾病及食物中［２－３］公司；柱式基因组ＤＮＡ抽提试剂盒购自天根生化

5、毒的主要因子。根据生物学特性和基因结构相科技（北京）有限公司；ＥＤＴＡ、Ｔｒｉｓ－ｂａｓｅ等购自北京关性解析，目前已发现了ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ、ＳＥＤ、鼎国生物技术公司；其他生化试剂均为国产或进口ＳＥＥ、ＳＥＧ－Ｉ及ＳＥＲ－Ｔ１１种肠毒素，ＳＥ１Ｊ－Ｑ、分析纯试剂。ＳＥ１Ｕ－Ｘ１２种肠毒素类似毒素和毒性休克综合征毒素１（ＴＳＳＴ－１）等２４种葡萄球菌超抗原毒素［４－７］。１．１．３仪器设备ＭＣＶ－１３１ＢＮＦ超净台为日本国内外有较多奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌毒素基因ＳＡＮＹＯ公司产品；ＳＩＧＭＡ１－１４冷冻台式离

6、心机为流行情况的调查研究，从患乳腺炎奶牛乳样中分离Ｓｉｇｍａ公司产品；ＵＶ－１２４０紫外分光光度计为日本的金黄色葡萄球菌近８０％产生超抗原毒素，但不同岛津公司产品；全自动数码凝胶成像分析系统为＋地区分离株所含超抗原毒素基因型不同，本研究根ＢＩＯ－ＲＡＤ公司产品；ＭＧ２５ＰＣＲ扩增仪为杭州朗据金黄色葡萄球菌肠毒素基因（ｓｅａ～ｓｅｅ）、中毒性休基公司产品。克综合征毒素基因（ｔｓｔ）及ｆｅｍＡ、ｆｅｍＢ基因设计合１．２方法［８］成引物进行ＰＣＲ扩增，检测四平地区某牛场患病牛１．２．１引物设计合成参照Ｏｍｏｅ等报道设计

7、乳金黄色葡萄球菌分离株毒素基因分型情况，对不合成金黄色葡萄球菌ＳＥＡ－ＳＥＥ及ＴＳＳＴ－１等６种同地区和来源的金黄色葡萄球菌菌株之间关系及分超抗原毒素基因及金黄色葡萄球菌特异基因ｆｅｍＡ子流行病学的研究提供科学的理论依据，对及时有和ｆｅｍＢ的ＰＣＲ扩增引物（表１），引物由宝生物工收稿日期：２０１４－０７－０２基金项目：国家自然科学基金项目（３１２７２５８４）；大连市金州新区高新技术研究开发计划项目（２０１２－Ａ１－０５０）作者简介：孙颖（１９６１－），女，吉林通化人，高级实验师，主要从事动物微生物学与免疫学研究。

8、＊通讯作者孙颖等：牛乳金黄色葡萄球菌分离株超抗原肠毒素基因分型研究１５程（大连）有限公司合成。表１金黄色葡萄球菌超抗原特异引物序列及扩增片段Ｔａｂｌｅ１Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｎｄｓｉｚｅｓｏｆｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒｓ基因Ｇｅｎｅ引物名称Ｐｒｉｍｅ序列（５′～３′）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ长度／ｂｐＳｉｚｅＳＥＡ－１ＣＣＴＴ