革兰阴性超级细菌碳青霉烯酶基因和可移动耐药元件结构研究

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1、南方医科大学2010级硕士学位论文革兰阴性超级细菌碳青霉烯酶基因和可移动耐药元件结构研究StudyoncarbapenemasesgenesandmobilegeneticresitanceelementsamongGramnegativesuperbugs课题来源：自选学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院郑芬芮勇字教授J告床检验诊断学临床型硕士第一临床医学院2013年5月20日广州J燃刿硕士学位论文～革兰阴性超级细菌碳青霉烯酶基因和可移动耐药元件结构研究硕士研究生：郑芬指导教师：芮勇宇教授摘要研究背景与目的近年来，随着碳青霉烯类药物的大量广泛使用，碳青霉烯耐药的革兰

2、阴性超级细菌检出率越来越高，成为临床感染治疗面临的重要难题，其耐药机制研究己成为全球关注的热点。细菌对碳青霉烯类抗生素耐药机制复杂，其中产能灭活碳青霉烯类抗生素的碳青霉烯酶是最重要的原因。细菌耐药性迅速产生及扩散的最主要原因是耐药基因的水平转移，耐药基因得以在同种或不同种属的细菌间广泛传播是通过多种机制实现的，如接合性质粒、转座子、整合子或插入序列共同区(ISCR)等可水平转移的基因元件。目前国内外的研究，主要集中在可携带多种耐药基因盒的整合子和可携带多种耐药基因盒且传播能力更强的插入序列共同区(IS础1)上。本研究主要对临床分离的G一杆菌超级细菌进行常见碳青霉烯酶基因检测，对常见

3、可移动耐药元件I类整合子和ISCRl进行检测，了解他们在超级细菌中的分布及结构特征，探讨超级细菌的耐药机制。对重要菌株如NDM和KPC型的超级细菌进行基因定位分析，并对KPC型超级细菌进行MLST和基因环境分析，以了解耐药基因水平转移方式。另外，本研究特别针对两个水解谱广、水解功能强的重要基因NDM和KPC，建立一种快速、敏感、特异的双重荧光定量PCR方法，能在单一体系同时检测NMD和KPC。摘要研究方法1．菌株选取和药敏实验及模板DNA制备收集南方医科大学南方医院检验科微生物室2011年7月至2012年7月临床分离的来自不同科室不同标本类型的耐碳青霉烯类抗生素的肠杆菌科细菌、不动

4、杆菌、铜绿假单胞菌。所有菌株的鉴定和药敏试验是利用BDl00全自动细菌鉴定仪完成。对收集的菌株用SDS裂解，蛋白酶K消化，酚一氯仿提取，醋酸钠．乙醇沉淀的方法提取细菌的全基因组DNA。2．常见碳青霉烯酶基因检测利用普通PCR方法对所有菌株进行7种常见碳青霉烯酶基因KPC、NDM、VIM、IMP、SPM、GES、OXA．48，对于鲍曼不动杆菌特别加测OXA．23．1ike、OXA．24一like、OXA一51．1ike、OXA一58．1ike四群OXA类的碳青霉烯酶基因。对阳性PCR产物进行测序验证并确定其亚型。对NDM或KPC的阳性菌株进一步扩增16S核糖体基因序列并测序，以保证属

5、种鉴定的准确。3．耐药基因播散方式研究为对NDM和KPC基因进行定位，对NDM或KPC阳性的菌株进行质粒接合转移试验以探讨该耐药基因的播散方式。特别对产KPC的菌株进行MLST分型和基因环境研究，以和国内外已报道情况进行比较。4．常见耐药元件结构研究利用PCR分别扩增I类整合子和ISCRl的保守区，阳性菌株进一步扩增二者的可变区，利用限制性内切酶HinfI和RsaI酶切可变区，根据酶切图谱进行初步分类，不同的酶切谱型挑选2株进行可变区测序，分析序列的同源性得出耐药基因盒组合。对同时携带整合子和ISCRl的菌株扩增其串联区，以验证是否为复杂性I类整合子并通过测序得到复杂性整合子结构。

6、5．NDM和KPC基因双重qPCR法的建立将已知的NDM和KPC基因所有亚型序列分别进行同源性比对，找出保守区进行引物和TaqMan探针的设计。分别构建NDM和KPC基因的质粒标准品，以该标准品对双重qPCR体系进行优化。质粒定量后经过一系列10倍梯度稀释，使其浓度为II硕士学位论文108copies／gl～101copies／I-tl，采用优化好的双重体系评价该方法的敏感性和线性关系。同时选取105copies／g浓度的质粒连续三天重复检测，每次做三个复孔，通过计算各自CT值的变异系数进行重复性和稳定性的评价。利用不含目的基因的标准株(大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌A

7、TCC27853、肺炎克雷伯菌ATCC70060和金黄色葡萄球菌ATCC25923)对该方法进行特异性评价。对经普通PCR和测序验证NDM和KPC基因已知的220株临床分离的肠杆菌科细菌(200株碳青霉烯敏感株和20株非敏感株)，利用已建立的双重qPCR方法进行检测，比较与普通PCR检测结果的符合率。研究结果1．碳青霉烯酶基因检测结果16株碳青霉烯耐药肠杆菌科超级细菌中：10株携带NDM一1基因包括4株阴沟肠杆菌、3株肺炎克雷伯菌、l株产酸克雷伯菌、1株产气肠杆菌和1