铁载体高产菌的筛选及铁载体的分离纯化

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1、铁载体高产菌的筛选及铁载体的分离纯化学位论文完成日期：2013—4—8指导教师签字：茎兰垒喳答辩委员会成员签字：二盖—吐．泓J碰青岛科技大学研究生学位论文铁载体高产茵的筛选及铁载体的分离纯化摘要铁是生命有机体的必需元素，在生物的代谢过程中起着重要作用。在微生物的代谢过程中，铁元素是多种酶的辅基或激活剂，如细胞色素、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶、铁氧还蛋白及铁硫蛋白酶等都需要铁作为活性基。生物缺铁时上述代谢过程均会受到显著的影响。铁载体(siderophore)是微生物在低铁应激条件下产生的一种能够高效率结合三价铁离子的低分子量(500．1000Da)有机化合物，其生物合成过程

2、受环境中铁离子浓度的严格控制。本研究采用LB培养基和2216E培养基从青岛近海海鱼的肠道和鱼鳃中共分离纯化出326株细菌。通过CAS固体和液体方法共筛选出52株铁载体高产菌株，铁载体表达量均在50％以上。通过高氯酸铁实验、氯化铁实验、Csaky实验和Arown实验，对所筛选出的52株铁载体高产细菌进行铁载体类型检测，结果显示，能够产生异羟肟酸类铁载体的细菌有30株，能够产生儿茶酚类铁载体的细菌有16株，还有13株菌所产的铁载体类型无法确定，其中有8株菌既能够产生儿茶酚类铁载体又能够产生异羟肟酸类铁载体。其中菌株CB—EH．2为产铁载体的优势菌株，铁载体表达量为83．117％

3、，达到6．299mgm。利用16SrDNA序列比对，发现菌株CB—EH．2属于Cobetiamarina。通过考察2，2’一联吡啶以及铁离子浓度对菌株CB．EH一2生长和产铁载体的影响，结果显示：1)当2，2’一联吡啶的浓度为501xmol／L时，铁载体产量最高；当2，2’一联吡啶的浓度超过200肚mol／L时，菌株不生长，说明微量的2，2’一联吡啶能够刺激菌株CB．EH．2产生铁载体；2)当铁离子的浓度超过10IJtmol／L时，菌株处于富铁的环境，从而抑制了菌株铁载体的合成，而铁离子浓度的增加对菌体产量影响不大。采用大孔吸附树脂XAD一2、葡聚糖凝胶色谱(Sephade

4、xHL一20)等方法对菌株CB—EH一2的发酵上清液中的铁载体进行了初步分离纯化，该部分纯化产物能够抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、灿烂弧菌4501和鳗弧菌VBl的生长，同时利用高效液相色谱及电喷雾电离子质谱联用(LC—MS)对部分纯化产物进行了测定，实验结果显示该产物中包含两种物质，其中一种为铁载体，另一种为脂肽类物质。关键词：铁载体CAS检测海洋细菌异羟肟酸儿茶酚THESELECTlONOFHIGH—YIELDSIDEROPHPRESPRODUCINGSTRAINSANDSEPARATlONANDPURIFlCATIONOFSIDEROPHORESABSTRACTIron

5、isanessentialelementofthelivingorganisms，itplaysanimportantroleinthemetabolicprocessesoftheorganisms．Inmicrobialmetabolicprocesses，theironisthecofactororactivatorofmanyenzymes，suchascytochrome，cytochromeoxidase，catalase，ferredoxinprotein，ironsulfurproteaseandSOon．Ontheconditionthatorganism

6、sarelackofiron，themetabolicprocessesabovewillbeimpactedsignificantly．Siderophoreisalowmolecularweight(500—1000Oa)organiccompoundthatmicroorganismproducesinlowironstressconditions，andcancombinewithFe’+efficiently．Itsbiosynthesisisstrictlycontrolledbytheconcentrationofiron．Inthisstudy,326str

7、ainsbacteriawereisolatedfromtheintestineandgillsofmarinefishesfromtheoffshoreareaofQingdaobyusingLBmediumand2216Emedium．52high—yieldsiderophore—producingstrainswereselectedbyemployingCASsolidandliquidmethods，theirproductivityareallabove50％．30ofthe52high·yields