烟草根际铁载体产生菌ardra分析、铁载体拮抗活性研究及fur基因克隆

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2、业大学硕士学位论文烟草根际铁载体产生菌ARDRA分析、铁载体拮抗活性研究fur基因克隆摘本研究对分离到的烟草根际铁载体产生菌进行了遗传多样性分析，从中筛选到一株限铁条件下对烟草疫霉有较好拮抗作用的地中海假单胞菌，研究了其铁载体对烟草疫霉的拮抗活性，克隆了其铁吸收调控蛋白基因，并用转座子诱变法获得了其铁载体合成缺失突变株，得出如下结论：1、用16SrDNAPCR扩增产物的限制性酶切分析(。d浓DRA)、16SrRNA序列同源性和进化树分析等方法，对从烟草根际分离到的299铁载体产生细菌进行了遗传多样性分析。这299个分离物分属于28个ARDRA类型，由测序结果进一步可知分属于p．

3、，丫，a．变形杆菌、鞘氨醇杆菌、芽孢杆菌和放线菌纲的14个不同的属。尤其是由假单胞菌、肠杆菌、沙雷氏菌、泛菌、欧文氏菌和窄食单胞菌构成的丫-变形杆菌占据了18个ARDRA类型。研究结果展示了比以往研究更为丰富的铁载体产生细菌多样性，例如，首次报道了鞘氨醇杆菌G．2．21．1和G-2．27．2、PseudomonaspoaeG．2．1．1、内共生肠产气杆菌G．2．10．2和N．5．10、食酸丛毛单胞菌G．1．15、木糖氧化无色杆菌N．46．11HH和N．5．20在限铁条件下产生铁载体。其中95％以上的铁载体产生菌属于革兰氏阴性菌，枯草芽孢杆菌和红平红球菌是仅有的两类革兰氏阳性菌。

4、进一步研究发现，假单胞菌和肠杆菌占了产生铁载体总菌数的50％以上，还发现75％以上的产生高铁载体活性单位(40～60)的细菌属于假单胞菌。2、从烟草根际筛选到一株限铁条件下烟草疫霉[Phytophthoraparasiticavar．nicotianae(BredadeHann)Tucker]拮抗菌G．229．21T。该菌产生高亲和力铁载体。通过形态特征、生理生化实验、16SrRNA序列同源性和系统发育分析及种特异性分子法鉴定，确定其属于Pseudomonas烟草根际铁载体产生菌ARDRA分析、铁载体拮抗活性研究及扣，基因克隆mediterranea。XAD．2吸附层析法提取其

5、铁载体，分光光度法检测其产生羧酸型铁载体。该铁载体，在低铁条件下(O．16肛moⅥ广10岫ol／LFeCl3)对烟草疫霉的抑制率达92．3％以上，而在富铁条件下(100阻nol／LFcCl3)抑制率仅为2．O％。3、采用兼并引物PCR和TAIL．PCR(ThermalasymmetricinterlacedPCR)法，获得了完整的Pmediterranea(3-229．21T铁吸收调控蛋白基因序列。该基因与PseudomonasfluorescensPfO．1fur基因的同源性最高为82％，其编码蛋白质含有104个氨基酸，与PfluorescensPfO．1Fur蛋白的同源性最

6、高为86％。并通过Swiss-Model对其Fur蛋白空间结构进行了模拟。4、用抗生素平板法对PmediterraneaG-229．21T进行抗药性试验，G一229．21T对卡那霉素敏感，能够耐受201ag／mL以上的氯霉素。利用转座子Tn5．1063a对G-229．21T进行转座子插入诱变，筛选出l株铁载体合成缺失突变株：G．229．21TA。用Pmediterranea特异性引物PC5／1和PC5／2，以突变株基因组为模板进行了特异性扩增，证实了突变株由出发菌株突变而来。根据转座子Tn5．1063a上luxA序列，设计引物，分别以G．229．21T总DNA、pRLl063a

7、DNA和突变株总DNA进行PCR扩增，测序结果表明，突变株G．229．21TA的luxA序列与已知的luxA序列同源性为100％，由此证实转座子Tn5．1063插入到G-229-21T基因组中。关键词：烟草根际，铁载体，ARDRA．Pseudomoirla$mediterranea，基因克隆2山东农业大学硕士学位论文ARDRAanalysis，antagonisticactivityofsiderophorel-l—l‘⋯■l●analysisandJurgenecloningotslder