白僵菌胞外蛋白酶的测定及其与酯酶型的关系[1]

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1、维普资讯http://www.cqvip.com一砷中国生物防治CHINESEJOURNALOFBIOLOGICALCONTROL1997．13(I)3236白僵菌胞外蛋白酶的测定及其与酯酶型的关系①林华峰、／增智樊美珍——一7(安徽农业大学植慑系，舍肥230036)·A[摘要]用明肢琼脂培养浩和营养液振荡培养法测定7自僵茴不同醋酶型菌株的肫外蛋自酶，并用前一种方法测定了同一醋酶型菌株的胞升蛋白酶现不同类型菌株闭和同一类型菌株内个体问胞外蛋白酶产生水平都有差异，少数几株差异显著。测定蛋白酶方法不能单独用来鉴别菌株。明胶琼脂培养法比营养藏振荡培养法较为准确可靠。／关键词白僵菌胞外蛋白

2、酶酯酶同酶球孢白僵菌(Beauveriabassiana)感染寄主昆虫主要有体壁和消化道两个途径，以体壁浸染更为常见(龙凤芝等，1988)。寄主体壁的外表皮是由腊质层和几层脂蛋白组成的复台结构，穿透这层复合结构是入侵感染的首要条件生化试验已表明，白僵菌在一定培养条件下能产生胞外蛋白酶、几丁质酶和酯酶等。这些酶的存在，在溶解寄主体壁进行人侵过程中起着重要的作用。Bidochka等(1987，1988，1990，1994)对球孢白僵菌胞外蛋白酶的基本生化特性进行了系列研究；胡锦江等(1993)研究了不同转代的产酶水平与毒力的关系．指出了其逐代降低的特点，并且发现在两种培养基中的产酶量和

3、产酶方式不同。樊美珍等(1994)的研究表明了其产酶量与毒力存在明显的相关关系。为了进一步比较白僵菌不同菌株的生化特性，我们在电泳技术测定不同分离株的酯酶型(林华峰．待发表)基础上，采用两种不同培养方式和测定方法测定了不同酯酶型菌株的胞外蛋白酶产酶水平，并用其中一种方法测定了同一酯酶型的不同分离株的产酶量，进而分析蛋白酶产生量与酯酶型的相关性。1材料和方法1．1供试菌株采用不同来源，经酯酶同工酶测定属于不同酯酶型的菌株10株；来自同一地区同一酯酶型的分离株27株。不同酯酶型的菌株原寄主及采集地点见表1。同一酯酶型的分离株·分别于1994年5月和1995年4月采自安徽宣州市麻姑山林场

4、，分布于不同海拔高度、不同山坡朝向、不同郁闭度的马尾松树林。1．2明胶琼脂平板测定法(方法一)参照Bidochka等(1990)的方法。平板由1的明胶和1．5的琼脂(均为W／V)配成。各试株配成1×10孢子／mL的菌悬液．用微量取液器取5,uL点滴在平板上，每试株6次重复，26c下培养3天后，用l5(w，V)的Hgc1(溶于2mol／L的HCI中)溶液处理平板，菌落周围显现出清晰的透明环后．倒去HgC!。液。用卡尺量度纵横两个方向特此矗谢本文系国家“八五”攻关项目8_o2加专题内容的一部分本试驻得到西北林学院胡锦江副教授的技术帮助一32—维普资讯http://www.cqvip.c

5、om的透明环直径及菌落直径，以透明环与菌落直径平均值之比作为胞外蛋白酶产酶量的指示值。1．3几丁质营养液测定法(方法二)1．3．1几丁质营养液成份每100mI水溶液中几丁质(S~ma公司生产)lg，NaCI、K2HP~、MgSO{各0．3g。1．3．2菌体培养将各酯酶型菌悬液按培养液体积1接人，不接菌为对照，27C100r／rain振荡培养3天．取样检测。1．3．3酶活性测定用2酪蛋白(用0．02tool磷酸缓冲液配制，pH7．0)lmL加到等量过滤后的酶液中，40c下反应10分钟．~I2mL0．4tool三氯醋酸溶液中止反应．保温至完全沉淀。对照是在酶液中．先加三氯醋酸，使酶失活

6、，再加酪蛋白。经滤纸过滤后取反应液lmL，加0·4m0lNa!CO液5mL再加Folin工作液(1份原液加2份蒸馏水)lmL，40C下保温20分钟，使其显色(蓝色)。用721型分光光度计测定68011m处的光密度。根据光密度值计算酶活性值(周德庆·1986)。1．3．4标准曲线制作将酪氨酸(分析纯)配成7个浓度梯度(o～60vg／mL)，每浓度lmL，取代上述的酪蛋白与酶被中止后的反应物。显色、比色过程同上。得到不同浓度酪氨酸反应物的光密度值，绘图．拟台得一直线方程。1．3．5酶活力计算’以每分钟催化分解蛋白质生成1Fg酪氨酸的酶量为一个活力单位。蛋白酶活力(单位／mL)：△O·D

7、·K·4／10N式中：△O·D为样品的光密度值(用对照校正后)；K为光密度1．000所对应的酪氨酸浓度，由标准曲线方程求得；N为酶液的释稀倍数(本试验用原浓度酶渡，故N为1因为4mL反应液中只取lmL，反应时间为10分钟，故乘以4／10表示)。2结果与分析2．1不同醇酶型菌株两种测定方法中的蛋白酶产酶水平在方法一中．测出的透明环直径与菌落直径之比见表1。比值越大，表明胞外蛋白酶活性越强，产酶水平越高。方差分析结果表明．只有B—I与B-25，B—S存在明显差异(p一0-