小麦纹枯病菌产生的一种胞外蛋白酶及其致病机理的研究

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1、山东农业大学博士学位论文小麦纹枯病菌产生的一种胞外蛋白酶及其致病机理的研究姓名：赵蕾申请学位级别：博士专业：植物病理学指导教师：张天宇2003.5.25关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关

2、数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名：螫导师签名：塑多日期：竺!牟6,-1矽B山东农业大学博士学位论文摘要小麦纹枯病是我国小麦的主要病害之一，近年来发病面积广，为害严重。为了深入阐明病害的发生机理，进一步揭示细胞壁降解酶在植物一病原互作中的作用，从而为病害的防治提供新的理论依据及防治手段，本文针对病原菌致病因子研究中的薄弱环节，对小麦纹枯病菌(RhizoctoniacerealisVanderHoeven)产生的胞外蛋白酶及其致病机理进行了研究，具体结果如下：1．从山东省各

3、地采集到的小麦纹枯病病株上分离到19株小麦纹枯病菌分离系(isolates)。／经Giemsa染色鉴定，细胞为双核，菌丝分枝接近直角，符合纹枯菌《{(Rhizocto"蛔cP旭日lisVanderHoeven)的特点止且、～2．x光片结果显示，小麦纹枯病菌(R．cereal括)在以小麦细胞壁为唯一碳氮源的诱导培养基中可产生多种蛋白酶。豫佳产酶时间为48h。培养液经硫酸铵沉淀、SP．SepharoseFastFlow阳离子交换层析、Phenyl—SepharoseFastFlow疏水层析、SephadexG一75分子筛层析分离纯化到一种蛋白酶(RCPl)

4、。经SDS．PAGE电泳银染后呈单带，分子量约为40kD?尸～／3．用azocasein为底物测定了温度和pH对蛋白酶RCPl活性的影响。结果表明：RCPl的最适温度为37。C，最适pH值为8．0。在热稳定性方面，25。C以下保温60min后仍保持原有酶活力的90％。35。C以上酶失活速度加快，60min后酶活下降了55％，456C以上处理60min酶活力基本丧失。在pH稳定性方面，以不同pH值，4"C处理1h显示，RCPl在pH610的范围内具有很高的稳定性，酶活力基本保持不变。金属离子Na+、Zn2+对酶活无影响，Mn2+、M92+对酶活有部分抑制

5、作用，Cu2+、Fe”、Pb2+对酶活有强烈的抑制作用，Ca2+在低浓度下对酶活有激活作用。．>夕74．为进一步鉴定蛋白酶RCPI的性质，本研究进行了专一性底物和抑制剂特性试验。／底物专一性测定显示，RCPl能水解胰蛋白酶专一性底物Benz．Phe-Val-Arg-NA，对D—Val．Leu—Arg—NA、Benz—Pro．Phe．Arg-NA和D．Val-Phe—Lys．NA也有活性，说明RCPl能降解Arg和Lys形成的酰胺键和肽键，具有类胰蛋白酶活性。RCPl对凝乳弹性蛋白酶底物Suc．AIa．Ala．Pro．Phe．NA和枯草杆菌蛋白酶底物CB

6、Z—Gly．Gly．Leu-NA无活性。抑制剂结果显示，RCPl能被胰蛋白酶抑制剂aprotinin、leupeptin和soybeantrypsininhibitor强烈抑制，丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF能部分抑制酶的活性，表明其活性中心有Ser残基，半胱氨酸蛋白酶抑制剂iodoacetamide和天冬氨酸蛋白酶抑制剂pepstatin小麦纹枯病菌产生的一种胞外蛋白酶及其致病机理的研究对酶活无影响。以上结果表明，RCPl是丝氨酸蛋白酶中的一种类胰蛋白酶。土／5．在RCPl致病机理的研究方面，本研究用提取的小麦细胞壁作为底物，分别测定了酶作用后底物中的蛋

7、白含量及产物中羟脯氨酸含量的变化。i结果表明，酶作用后底物中的蛋白含量比对照减少了34．58％。产物中的羟脯氨酸含量明显增高，释放出的羟脯氨酸量是同时加入类胰蛋白酶抑制剂aprotinin处理的3．5倍，说明蛋白酶RCPl能够降解寄主小麦细胞壁。j6．为直接观察类胰蛋白酶RCPl对活体小麦组织超微结构的影响，本研究采用了将纯化的RCPl蛋白酶液注入到活体小麦叶片，25℃保温24h后进行电镜观察的新方法，俦以往用酶液浸泡植物离体组织的方法相比，方法更为科学，既能保证酶液进入植物组织，又能保证电镜制片时的活体要求，所示结果更为可靠，为今后同类研究积累了经验

8、。得到的植物病原真菌产生的蛋白酶对植物细胞壁及膜系统超微结构影响的电镜照片显示，处理的小麦组织