蛋白酶的测定

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1、2.蛋白酶的发酵与酶活力测定2.1实验目的1）了解蛋白酶产生菌的生长情况，学会绘制其生长曲线。2）了解蛋白酶的性质及蛋白酶的测定原理；掌握蛋白酶的发酵及酶活力测定方法。2.2实验原理将活化好的试验菌种制成菌悬液，转接到产蛋白酶发酵培养基，直接进行发酵培养，每隔3h取一次样，测量它的OD值，绘制产蛋白酶芽孢杆菌生长曲线。蛋白酶在一定的温度与pH条件下水解酪素底物，产生含有酚基的氮基酸(如:酪氨酸、色氨酸等)，在碱性条件下，将福林试剂(Folin)还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光光度法测定，计算其酶活力2.3实验仪器与实验材料：菌种：产蛋白酶芽孢杆菌斜面菌种；酶源：蛋白酶

2、发酵液；培养基及试剂：牛肉膏蛋白冻液体培养基；酪素培养基、蛋白酶活力检测试剂仪器：紫外分光光度计、恒温水浴锅、量筒、试剂瓶、接种针、玻璃棒、移液枪、10ml离心管28-32个、试管4支、PH计等。2.4实验流程：第一天（2012年5月17日）实验内容：种子培养液与发酵培养液制备实验试剂：产蛋白酶芽孢杆菌菌种、种子培养液（不加琼脂的牛肉膏蛋白胨液体培养基）、发酵培养液（不加琼脂的酪素培养基，酪素减半，其余不变）、1mol/LNaOH、1mol/LHcl实验器材：250ml锥形瓶3个、玻璃棒、接种环、100ml烧杯3个、胶头滴管1个、封口膜、标签、摇床、电子天平、PH

3、计、10ml移液管、离心管13支等。实验步骤：1、按配方配制牛肉膏蛋白冻液体培养基100ml作为种子培养液，装入250ml锥形瓶中2、按配方配制发酵培养液2份，各100ml装入250ml锥形瓶中（分别记为1号、2号）3、将实验所用器具（玻璃棒、接种环、移液管、试管）及培养基（250ml，用封口膜包扎）进行高压蒸汽灭菌（0.1MPa、121℃、20min）。4、待培养基冷却后，在超净工作台上用接种环从斜面培养基上取2环产蛋白酶芽孢杆菌，接种到种子培养基内，放到摇床上，在31℃摇床培养16h。第二天(2012年5月18号)实验内容：发酵培养液接种发酵与取样实验步骤：1

4、、种子培养12-16h后，从摇床上取出种子液，冷却一段时间。2、用移液管取10ml种子液，放到1号瓶内，（以上午10点为例），摇匀，立即用离心管取5ml样液，记为0h，作为空白管，放入4℃冰箱中保藏。用完种子液后立即放入冰箱中保藏。然后1号瓶进行31℃摇床培养3、隔三个小时取一次样，每次均用10ml离心管取样5ml，记上3h、6h、9h、12h，放入4℃冰箱中保藏。4、提前将种子培养液取出，恢复到室温，22点给2号瓶接10ml种子液，31℃摇床培养12h第三天(2012年5月19日)实验内容：发酵培养液发酵与取样、测蛋白酶和菌体溶液OD值绘制生长曲线、测酶活力实验

5、器材：胶头滴管1个、移液管或移液枪、离心管、试管4支实验步骤：1、在13点开始向2号瓶取样，接下来每隔三个小时取一次样，每次均用10ml离心管取样5ml，分别记上15h、18h、21h、24h后，立即放入冰箱中保藏。2、同时在16点开始向1号瓶取样，接下来每隔三个小时取一次样，每次均用10ml离心管取样5ml，分别记上27h、30h、33h、36h后，立即放入冰箱中保藏。3、取完后，将所有的离心管从冰箱里取出，一段时间恢复室温后，测量蛋白酶和菌体溶液在600nm处的OD值，用蒸馏水调0，用0h作空白管4、蛋白酶活力测定（福林法）（可在等待时间进行操作）⑴绘制标准曲

6、线：.a.L-酪氨酸标准溶液:按表A3配制1、b.分别取上述溶液各1.00ml（须做半行试验)，各加0.4mol/L碳酸钠溶液5.00ml、福林试剂使用溶液1.00ml，置于40℃士0.2℃水浴中显色20min，取出，用分光光度计于波长680nm,10mm比色皿，以不含酩氨酸的0管为空白，分别测定其吸光度。以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线(此线应通过零点)。据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量如（ug)，即为吸光常数K值，其K值应在95-100范围内。⑵测定酶活力酶试样的制备：取9h或12h，18h，24h，30h的离心管高

7、速离心，3500n/min，10min后，取上层清夜5ml装到新离心管中，重新做上标记a.先将酪素溶液放人40℃士0.2℃恒温水浴中，预热5minb.按下列程序操作:试管A(空白)↓加酶液1.00ml↓40℃士0.2℃,2min加三氯乙酸2.00ml(摇匀)↓40℃士0.2℃,10min加酪素1.00ml（摇匀）↓试管B(酶试样，需要三个平行试样)↓加酶液1.00m↓40℃士0.2℃,2min加酪素1.00ml（摇匀）↓40℃士0.2℃,10min加三氯乙酸2.00ml(摇匀)↓取出静止10min，过滤↓取出1.00ml滤液↓加碳酸钠溶液5.0ml↓加福林试剂使用

8、液1.00