蛋白酶活性的测定

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1、华南农业大学综合实验报告实验项目名称：酶活力测定实验项目性质：综合实验计划学时：所属课程名称：食品与发酵工业分析实验完成时间：2013.05.10糖化酶活力测定（直接滴定法）1、原理采用可溶性淀粉为底物，在一定的pH值与温度下，使之水解为葡萄糖(还原糖)，以直接滴定法测定。2、试剂及仪器（1）碱性酒石酸铜钾溶液（使用时等体积混合甲、乙溶液）：甲液：称取15.693g硫酸铜(Cu2SO4·5H2O)，0.05g次甲基蓝，用水溶解并稀释定容至1000mL；乙液：称取50g酒石酸钠钾，54g氢氧化钠，4g亚铁氰化

2、钾，用水溶解并稀释定容至1000mL（2）0.1%标准葡萄糖溶液：准确称取1g无水葡萄糖（预先在100-1050C烘干），用水溶解，加5mL浓盐酸，用水定容至1000mL。（3）pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲溶液：0.2mol/L乙酸溶液：量取11.8mL冰乙酸，用水稀释至1000mL；0.2mol/L乙酸钠溶液：称取27.2g乙酸钠（CH3COONa·3H2O），用水定容至1000mL；pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲液：取0.2mol/L的乙酸溶液和0.2mol/L的乙酸钠溶液等体积混合。（4）0.1mol/L氢

3、氧化钠溶液：称取4g氢氧化钠，用水溶解并定容至1000mL。（5）2%可溶性淀粉溶液：准确称取2g可溶性淀粉（预先于10-1050C烘干），加少量水调匀，倾入80mL沸水中，继续煮沸至透明，冷却后用水定容至100mL。（6）固体曲（7）滴定管、电子天平、烧杯、恒温水浴锅、脱脂棉、容量瓶、移液管、三角瓶3、测定步骤（1）5%固体曲浸出液制备：称取5.0g固体曲（以绝干曲计），置于250mL烧杯中，加90mL水和10mLpH4.6乙酸－乙酸钠缓冲溶液，搅匀，于30℃水浴中保温浸1小时，每隔15min搅拌一次。用

4、脱脂棉过滤，滤液为5％固体曲浸出液。（2）固体曲糖化液的制备：吸取25mL2％可溶性淀粉溶液，置于50mL容量瓶中，于30℃水浴预热10min。准确加入5mL5％固体曲浸出液，摇匀，立即记下时间。于30℃水浴准确保温糖化1小时。迅速加入15mL0.1mol/L氢氧化钠溶液，终止酶解反应。冷却至室温，用水定容至刻度。同时作一空白液：吸取25mL2％可溶性淀粉溶液，置于50mL容量瓶中，先加入15mL0.1mol/L氢氧化钠溶液，然后准确加入5mL5％固体曲浸出液，用水定容至刻度。（3）定糖空白液测定：吸取碱性

5、酒石酸铜甲、乙液各5mL，置于150mL三角瓶中，准确加入5mL空白液，并用滴定管预先加入适量的0.1%标准葡萄糖溶液，使滴定时消耗的0.1%标准葡萄糖溶液在1mL以内，摇匀。于电炉上加热至沸腾，立即用0.1%标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失，此滴定操作需在1min内完成。糖化液测定：准确吸取5mL糖化液代替5mL空白液，其余操作同上。4实验现象和数据记录表1定糖消耗的标准葡萄糖体积空白液糖化液滴定现象蓝→无色蓝→无色标准葡萄糖溶液消耗体积ml9.26.7（稀释了10倍）（其中在做定糖的糖化液预实验时发现用标准

6、葡萄糖溶液滴定糖化液时，没有滴加标准葡萄糖溶液时，糖化液在煮沸时由蓝色变为无色，所以我们小组把糖化液稀释了10倍后再做糖化液的定糖实验）5计算与结果固体曲糖化酶活力定义：1g绝干固体曲，在30℃、pH4.6、1小时内水解可溶性淀粉为葡萄糖的毫克数。即所以，实验测得的糖化酶的活力为341.2mg。式中：V0——5mL空白液消耗0.1%标准葡萄糖溶液的体积（mL）V——5mL糖化液消耗0.1%标准葡萄糖溶液的体积（mL）C——标准葡萄糖溶液浓度（g/mL）50/5——5mL糖化液换算成50mL糖化液中的糖量（g

7、）100/5——5mL浸出液换算成100mL浸出液中的糖量（g）W——绝干曲称取量（5.0g）1000——g换算成mg6分析与讨论该实验结果存在着误差，误差的原因：①我们小组的空白液和糖化液都只是做一次实验，而没有做平行实验，改进方法是各做3次平行实验；②因为我们的空白液滴定是用原液，而糖化液是用10倍稀释的，所以也会是结果不那么精确，改进放法：应把空白液也作10被稀释比较好。蛋白酶活性的测定（福林酚法）1原理蛋白酶在一定的温度pH条件下，水解酪蛋白底物，产生含酚基的氨基酸在碱性条件下，将福林还原，生成钼蓝

8、和钨蓝，在680nm处测吸光度。2仪器与试剂2.1仪器紫外分光光度计恒温水浴锅2.2试剂TCA酪蛋白溶液碳酸钠溶液福林试剂3实验步骤比色管A(空白）：加酶液1ml于大试管中于40oC水浴2min，再加TCA2ml于40oC水浴10min，加酪蛋白溶液1ml，摇匀，静置10min，过滤取滤液1ml于比色管中，加入碳酸钠溶液5ml，加入福林试剂1ml，于40oC水浴20min，再测吸光度。比色管B:加酶液1ml于大试