蛋白酶活性测定方法.doc

《蛋白酶活性测定方法.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、水产动物酶活性测定方法一、分析样品的采取与处理每箱随机各取3尾异育银鲫，称重,于冰盘上解剖，取出肠道和肝胰脏,测定肠道长度，剔除脂肪组织，用4℃冷却的去离子水冲洗；然后用滤纸轻轻吸去水分，放入—26℃冰箱中迅速冷却保存，供测酶活性用。二、酶液的制备将肝胰脏及肠组织缓慢解冻后，肠道匀分三等份，从前、中、后肠分别取有代表性食靡0.5g，放入离心塑料管中，加4ml，4℃冷却去离子水稀释，4℃下离心20min（13，000g），上清液标号分装，并与4℃冰箱中冷却保存，24Hr待测。将肝胰脏及肠道组织用4℃去离子水清除肠道内容物后，用滤纸吸去表面水，

2、取样各1.0g。按样品重量加10倍的4℃冷却去离子水在冰浴下匀浆（稀释匀浆液匀浆4min,800rpm匀浆玻璃管外设冰浴）。匀浆液在4℃下离心20分钟（13，000g），上清液标号分装，并于4℃冰箱冷却保存，24Hr内测定完毕。酶粉及饲料：取2．0克酶粉，先用10倍PH7.0缓冲液溶解，并放在40℃水浴中恒温30分钟，过滤留置滤液待测。测定前再稀释10倍，20倍，100倍即可。取2.0克饲料，加PH7.0缓冲液20ml溶解,并放在40℃水浴中恒温30分钟，过滤留置滤液待测。三、酶活性测定1.蛋白酶测定：前、中、后肠，肝胰脏。方法：福林—酚试

3、剂法1.1原理：蛋白酶从变性的酪蛋白中分解出可溶于三氯乙酸（TCA）的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等），这些氨基酸可用福林试剂使之发色（蓝色反应），用分光光度计测定。1.2蛋白酶活性单位：1克食靡或组织在30℃，PH在7.0的条件下，每分钟水解酪蛋白产生1微克酪氨酸的酶量为1个酶活力单位。1.3试剂1.福林试剂（已配）2.0.4M碳酸钠溶液：取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g用水溶解和定容至1，000ml，存放与具胶塞的试剂瓶中。3.0.1M三氯醋酸（TCA）：用小烧杯称取65.4g三氯醋酸，加水溶解后定容为1，000ml。4.L

4、—酪氨酸。5.缓冲液：磷酸二氢钙—氢氧化钠缓冲液。A：0.2mol/LKH2PO4(ml):50;B：0.2mol/LNaOH(ml)29.63C：水（ml）120.37PH（20℃）：7.06．酪蛋白溶液：精确称取酪素2.000g，先用少量0.5N氢氧化钠浸润后，加入少量缓冲液，在沸水浴中加热，经常但不要剧烈的搅拌使之完全溶解，冷却后移入100ml容量瓶中，并用相应的缓冲液定容到刻度。若定容时泡沫过多，可加入1~2滴乙醇消泡。酪蛋白溶液可在4℃保存一周，变质后不能使用。1.4标准酪氨酸曲线的绘制1.将精确称取L—酪氨酸（先在105℃干燥2

5、~3Hr）100mg小心地溶于60ml0.1mol/LHCL中制得酪氨酸溶液。酪氨酸必须完全干燥并且是色谱级别，一定要酪氨酸完全溶解，并且用去离子水稀释至1L，该溶液含酪氨酸100微克/毫升。2.根据下面的规定，从上述储备溶液制备含酪氨酸10、20、30、40、50、70、80微克/毫升。3.移取上述溶液2ml，加入一系列试管中，加5ml0.4MNa2CO3然后加稀释的福林试剂1ml至各试管，立即混合均匀，并在30℃恒温水浴中显色20min，以721型（或72型）分光光度计在波长680nm处测定光密度（O。D值）。4.计算K值；以OD值为纵

6、坐标，酪氨酸溶度为横坐标，绘制标准曲线，`微克数，确定K值。1.5操作步骤将酪蛋白溶液放入30℃恒温水浴中预热5min，取1ml酶液注入试管中，按以下程序操作。酶液1ml——————————————在30℃恒温水浴中预热1—2min+2%酪蛋白1ml——————————加入时立即记时，精确反应10min+0.4MTCA2ml—————————立即摇匀，终止反应。将各管剧烈混合并在30℃保持30min，以完全沉淀反应后过量的酪蛋白。从水浴中取出静止10min过滤（11cm的whatman43#滤纸）+滤液1ml+0.4MNa2CO35ml+稀

7、释福林试剂1ml摇匀，30℃恒温水浴显色20分钟测定OD值————————用720型分光光度计测定（波长680nm）空白试验：酶液1ml，先向其中加入三氯醋酸，然后加酪蛋白溶液。其余步骤同试验。1.6计算公式（公式1）活力单位=4/10×K×OD×n/m其中：4————反应总体积为4ml10————反应的时间为10minK————比色计常数n————酶液稀释倍数m----------样品的质量（g）（公式2）活力单位=∧×4×n/10/m其中：∧——————酶活力测定的光密度值，在标准曲线上查得响应的酪蛋白的微克数。4——————反应的总体

8、积10——————反应10分钟n——————酶稀释倍数m------------------样品的质量（g）2碘—淀粉比色法测定淀粉酶2．1原理淀粉酶能水解淀粉生成葡萄糖、麦芽糖