蛋白酶活性测定方法

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时间:2019-11-26

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1、水产动物酶活性测定方法一、分析样品的采取与处理每箱随机各取3尾异育银鲫,称重,于冰盘上解剖,取出肠道和肝胰脏,测定肠道长度,剔除脂肪组织,用4℃冷却的去离子水冲洗;然后用滤纸轻轻吸去水分,放入—26℃冰箱中迅速冷却保存,供测酶活性用。二、酶液的制备将肝胰脏及肠组织缓慢解冻后,肠道匀分三等份,从前、中、后肠分别取有代表性食靡0.5g,放入离心塑料管中,加4ml,4℃冷却去离子水稀释,4℃下离心20min(13,000g),上清液标号分装,并与4℃冰箱中冷却保存,24Hr待测。将肝胰脏及肠道组织用4℃去离子水清

2、除肠道内容物后,用滤纸吸去表面水,取样各1.0g。按样品重量加10倍的4℃冷却去离子水在冰浴下匀浆(稀释匀浆液匀浆4min,800rpm匀浆玻璃管外设冰浴)。匀浆液在4℃下离心20分钟(13,000g),上清液标号分装,并于4℃冰箱冷却保存,24Hr内测定完毕。酶粉及饲料:取2.0克酶粉,先用10倍PH7.0缓冲液溶解,并放在40℃水浴中恒温30分钟,过滤留置滤液待测。测定前再稀释10倍,20倍,100倍即可。取2.0克饲料,加PH7.0缓冲液20ml溶解,并放在40℃水浴中恒温30分钟,过滤留置滤液待测。

3、三、酶活性测定1.蛋白酶测定:前、中、后肠,肝胰脏。方法:福林—酚试剂法1.1原理:蛋白酶从变性的酪蛋白中分解出可溶于三氯乙酸(TCA)的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等),这些氨基酸可用福林试剂使之发色(蓝色反应),用分光光度计测定。1.2蛋白酶活性单位:1克食靡或组织在30℃,PH在7.0的条件下,每分钟水解酪蛋白产生1微克酪氨酸的酶量为1个酶活力单位。1.3试剂1.福林试剂(已配)2.0.4M碳酸钠溶液:取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g用水溶解和定容至1,000ml,存放与具胶塞的试剂瓶中。

4、3.0.1M三氯醋酸(TCA):用小烧杯称取65.4g三氯醋酸,加水溶解后定容为1,000ml。4.L—酪氨酸。5.缓冲液:磷酸二氢钙—氢氧化钠缓冲液。A:0.2mol/LKH2PO4(ml):50;B:0.2mol/LNaOH(ml)29.63C:水(ml)120.37PH(20℃):7.06.酪蛋白溶液:精确称取酪素2.000g,先用少量0.5N氢氧化钠浸润后,加入少量缓冲液,在沸水浴中加热,经常但不要剧烈的搅拌使之完全溶解,冷却后移入100ml容量瓶中,并用相应的缓冲液定容到刻度。若定容时泡沫过多,可

5、加入1~2滴乙醇消泡。酪蛋白溶液可在4℃保存一周,变质后不能使用。1.4标准酪氨酸曲线的绘制1.将精确称取L—酪氨酸(先在105℃干燥2~3Hr)100mg小心地溶于60ml0.1mol/LHCL中制得酪氨酸溶液。酪氨酸必须完全干燥并且是色谱级别,一定要酪氨酸完全溶解,并且用去离子水稀释至1L,该溶液含酪氨酸100微克/毫升。2.根据下面的规定,从上述储备溶液制备含酪氨酸10、20、30、40、50、70、80微克/毫升。3.移取上述溶液2ml,加入一系列试管中,加5ml0.4MNa2CO3然后加稀释的福林

6、试剂1ml至各试管,立即混合均匀,并在30℃恒温水浴中显色20min,以721型(或72型)分光光度计在波长680nm处测定光密度(O。D值)。4.计算K值;以OD值为纵坐标,酪氨酸溶度为横坐标,绘制标准曲线,`微克数,确定K值。1.5操作步骤将酪蛋白溶液放入30℃恒温水浴中预热5min,取1ml酶液注入试管中,按以下程序操作。酶液1ml——————————————在30℃恒温水浴中预热1—2min+2%酪蛋白1ml——————————加入时立即记时,精确反应10min+0.4MTCA2ml————————

7、—立即摇匀,终止反应。将各管剧烈混合并在30℃保持30min,以完全沉淀反应后过量的酪蛋白。从水浴中取出静止10min过滤(11cm的whatman43#滤纸)+滤液1ml+0.4MNa2CO35ml+稀释福林试剂1ml摇匀,30℃恒温水浴显色20分钟测定OD值————————用720型分光光度计测定(波长680nm)空白试验:酶液1ml,先向其中加入三氯醋酸,然后加酪蛋白溶液。其余步骤同试验。1.6计算公式(公式1)活力单位=4/10×K×OD×n/m其中:4————反应总体积为4ml10————反应的时

8、间为10minK————比色计常数n————酶液稀释倍数m----------样品的质量(g)(公式2)活力单位=∧×4×n/10/m其中:∧——————酶活力测定的光密度值,在标准曲线上查得响应的酪蛋白的微克数。4——————反应的总体积10——————反应10分钟n——————酶稀释倍数m------------------样品的质量(g)2碘—淀粉比色法测定淀粉酶2.1原理淀粉酶能水解淀粉生成葡萄糖、麦芽糖

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