角膜移植排斥反应相关的泪液蛋白组学研究

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1、万方数据指导小组成员名单导师：张朝然主任医师指导小组成员：徐建江主任医师金红高级工程师万方数据中文摘要⋯⋯⋯⋯一一英文摘要一一⋯⋯目录

2、IIIIIIIIIIIIIIIY2700976第一章：大鼠角膜移模型的建立和排斥反应相关蛋白组学分析日U吾一材料和方法一一一一结果一一一一一一讨论第二章抗排斥药物干预对于角膜移植排斥反应相关蛋白表达的影响—xL—jL一日U吾一⋯⋯⋯材料和方法一一～⋯一一⋯⋯一一一一结果一一一⋯⋯一一⋯⋯一一一一一讨论-36第三章人泪液中角膜移植排斥反应相关蛋白筛选及临床应用初探—1￡．—j一日U舌一一一一一一一一一⋯⋯一一一一⋯一一材料和方法一

3、结果⋯⋯一一讨论⋯一一参考文献在校期间论文情况一一一⋯一一一一致谢一一一⋯一一--5354论文声明⋯一⋯⋯一一⋯一一一一一一一⋯一63⋯一一71万方数据硕士论文角膜移植排斥反应相关的泪液蛋白组学研究摘要第一章l大鼠角膜移模型的建立和排斥反应相关蛋白组学分析目的建立大鼠自体移植模型和异体移植模型，通过同位素标记相对和绝对定量技术(iTRAQ)为基础的蛋白质组学研究筛选出与角膜移植排斥发生、发展相关的差异蛋白，并运用生物信息学技术，分析其与角膜移植排斥反应可能相关的机制，为进一步发展新的排斥反应监测、预防、治疗手段奠定基础。材料和方法i．成年Wistar大鼠42只，

4、随机分为三组，分别对右眼行同种异基因角膜移植(SD大鼠为供体，Wistar大鼠为受体)，同种同基因角膜移植(自体原位角膜移植)及空白对照。2．术后每天观察植片水肿、浑浊和新生血管情况。3．术后2、7、14天收集各组大鼠泪液，每只约10ul，冻存于80℃以备后用。4．将大鼠泪液样本离心后取上清液，经多重吸附去除系统(MARS)去除高丰度蛋白。然后对这些泪液标本进行蛋白提取、定量和酶解。5．iTRAQ八标试剂标记后(113标记空白对照组，115标记异体移植组2d，i16标记异体移植组7d，117标记异体移植组14d，118标记自体移植组2d，119标记自体移植组7d

5、，121标记自体移植组14d)，进行二维液相色谱一串联质谱(2DLC—MS／MS)分析。6．利用ProteinPilot软件进行搜库并定量。差异表达蛋白界值设定：大于2为显著上调(p

6、著性(p<0．05)。2．共鉴定出iTRAQ标记的差异蛋白277个。在异体移植组中2d、7d、14d这三个时间点发生显著上调／下调的蛋白分别为：35个、36个、31个。3．在异体移植组中，G0分析发现神经系统调节、自由基的清除、细胞的死亡与存活、细胞运动富集度较高；pathway分析显示LXR／RXR的活化、急性时相反应信号通路、网格蛋白介导的内吞作用信号通路和肌动蛋白细胞骨架信号通路富万方数据硕士论文角膜移植排斥反应相关的泪液蛋白组学研究集度较高。与自体移植相比，异体移植富集度显著增高的通路有：LXR／RXR的活化通路、网格蛋白介导的内吞作用信号通路。4．Co

7、ronin-iA在异体移植组中明显高于自体移植组。在异体移植组中，其在排斥开始发生时即7d达到峰值，而在自体移植组中，其随时间推移逐渐降低。5．Vitamin-Dbindingprotein(DBP)在移植组第14天明显上调。结论1．Itraq为我们从整体上了解角膜移植排斥发生、发展过程中蛋白质的差异表达，从而筛选出有意义的蛋白提供了良好的平台。对样本量小、极性蛋白、及酸性碱性蛋白具有很高的检出率，可信度高，可重复性强。泪液样本的收集对眼局部和全身无影响。由于泪液样本量较少，选用itraq技术对泪液中蛋白质的检测具有很高的效率。2．生物信息学的方法可以扩展思路和

8、视野，有助于我们进一步从整体上了解差异表达蛋白的功能和调控。本研究提示参与神经系统调节的蛋白与植片的排斥相关，而参与氧自由基的活化的蛋白与角膜内皮细胞凋亡以及白细胞积聚、免疫损伤和新生血管的形成相关。LXR／RXR通路可能通过影响脂质代谢、葡萄糖代谢和巨噬细胞相关基因表达影响植片的存活。肌动蛋白细胞骨架信号通路参与免疫细胞的趋化移行、抗原识别、信号转导、免疫突触形成、活化、增殖分裂等过程，从而影响免疫排斥反应。3．Coronin-iA可能是排斥发生早期有意义的生物学标记物，它通过影响T细胞的迁移和T细胞与APCs相互作用参与排斥反应的发生。4．DBP可能通过影响

9、巨噬细胞活化和趋化参与角