诱导前房相关免疫偏离与高危角膜移植排斥反应的相关性分析

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1、诱导前房相关免疫偏离与高危角膜移植排斥反应的相关性研究1材料材料与方法Materialandmethod1．1实验动物1．1．1建立高危角膜动物模型健康清洁级新西兰白兔20只，雄性，体重2．oo．2．50Kg，年龄2．3月，购自新疆自治区实验动物中心，饲养于兰州军区乌鲁木齐总医院重点实验室动物饲养中心，符合AssociationforResearchinVisionandOphthalmology(ARVO)有关研究目的动物的相关规定。1．1．2诱导前房相关免疫偏离健康清洁级新西兰白兔16只，购自新疆自治区实验动物中

2、心，碱烧伤角膜新生血管模型兔16只，从己制备好的CNV评分相近的角膜新生血管动物模型中随机抽取，动物标准及饲养条件同建立角膜新生血管动物模型。1．1．3前房相关免疫偏离对高危角膜移植排斥反应的影响选择健康清洁级家兔16只作为供体，受体为诱导前房相关免疫偏离部分实验的32只健康清洁级新西兰白兔，动物标准及饲养条件同建立角膜新生血管动物模型。1．2实验动物分组1．2．1建立高危角膜动物模型健康清洁级新西兰白兔20只不分组，全部用于制作高危角膜动物模型。1．2．2诱导前房相关免疫偏离诱导前房相关免疫偏离与高危角膜移植排斥反

3、应的相关性研究1．2．3前房相关免疫偏离对高危角膜移植排斥反应的影响按照诱导前房相关免疫偏离实验动物分组方法将受体分为4组，每组8只：A组：正常角膜常规角膜移植组(正常对照组)；B组：碱烧伤常规角膜移植组(碱烧伤对照组)；C组：正常角膜诱导ACAID的角膜移植组(正常诱导组)；D组：碱烧伤后诱导ACAID的角膜移植组(碱烧伤诱导组)。1．3主要药品及试剂1．3．1主要药品盐酸氯胺酮注射液(O．19／支，江苏恒瑞医药)盐酸氯丙嗪注射液(25mg／支，天津药业集团新郑股份)O．5％盐酸丙美卡因滴眼液(15ml／支，爱尔凯

4、因，Alcon)0．25％氯霉素滴眼液(8ml／支，重庆科瑞制药)氧氟沙星眼膏(5g／支，沈阳兴齐制药)复方托品酰胺滴眼液(8ml／支，北京双鹤现代制药)1％阿托品滴眼液(解放军第四七四医院制剂科)1mol／1的NaOH溶液(兰州军区乌鲁木齐总医院重点实验室)硫酸庆大霉素注射液(8万单位／支，天津药业集团新郑股份)透明质酸钠(Alcon)1．3．2主要试剂福尔马林溶液：4％甲醛溶液与PBS以1：9配制(解放军第四七四医院病理科)各梯度酒精、二甲苯、液体石蜡、苏木素／伊红(解放军第四七四医院病理科)PBS：磷酸盐缓冲液

5、，pH为7．2(福州迈新生物技术开发有限公司)牛血清白蛋白(BSA，59，Merk公司)完全弗氏佐剂(CFA，10ml，Sigma公司)平衡盐溶液(BSS，500ml，解放军第四七四医院制剂科)1．4主要仪器及材料显微手术器械：显微有齿镊，显微无齿镊，显微持针器，角膜镊，角膜剪，角膜环钻(7．5mm，7．75mm)，刻枕(苏州明仁医疗器械厂)；无菌手术包：弯盘2个，开睑器2个，有齿镊2个，无齿镊2个，持针器2个，止血钳2个，虹膜恢复器2个，10．0缝线，5．O缝线，角针，无菌敷料及棉签若干；3L粘贴伤口敷料(江西3L

6、医用制品集团有限公司)电子分析天平(BAllOS型，美国Sartorius公司)；微量取样器(10．1000ul范围)及取样枪头；冰箱(O℃、．20℃)(河南新飞有限公司)；显微镜及显微摄影装置(美国ZEISS)；4诱导前房相关免疫偏离与高危角膜移植排斥反应的相关性研究数码相机(日本SONY)；眼科手术显微镜(TOPCON)；裂隙灯显微镜(TOPCON)；无菌滤纸片若干；工程游标卡尺(精确度为0．01mm)；一次性无菌注射器(1ml，2．5ml，5ml，20m1)；2方法2．1高危角膜动物模型的建立2．1．1术前准备

7、健康清洁级新西兰白兔20只，术前3天生理盐水冲洗结膜囊，0．25％氯霉素滴眼液点眼，4次／日。术前30min以复方托品酰胺滴眼液散瞳。2．1．2麻醉方法表面麻醉：O．5％盐酸丙美卡因滴眼液(爱尔凯因)点眼3次。全身麻醉：用盐酸氯胺酮注射液(50mg／kg)和盐酸氯丙嗪注射液(25mg／kg)肌肉注射诱导实验动物全身麻醉。3．5分钟后实验动物进入浅麻醉状态，心率缓慢，呼吸匀称。2．1．3手术方法选择兔左眼制作模型，常规无菌操作，消毒左眼，铺无菌洞巾，开睑器开睑，无菌棉签吸去多余泪液，用微量取样器取1mol／1的NaOH

8、溶液30山滴于直径6mm的无菌干燥滤纸片上，lmin后将滤纸片轻轻置于兔左眼瞳孑L中央，烧灼lmin后取下，立即用20ml的PBS冲洗烧伤区及结膜囊lmin。碱烧伤后角膜中央迅速出现混浊，用PBS冲洗后混浊加重，变为瓷白色。术毕结膜囊涂氧氟沙星眼膏，烧伤后每日用0．25％氯霉素眼水滴眼，2次／日，预防感染。2．2碱烧伤后新生血管的观察2．2．1