脂肪干细胞复合牛心包膜修复兔腹壁缺损的实验研究

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1、硕士学位论文论文题目脂肪干细胞复合牛心包膜修复兔腹壁缺损的实验研究研究生姓名许培荣指导教师姓名吴氢凯专业名称妇产科学研究方向女性盆底重建论文提交日期2013年5月2脂肪干细胞复合牛心包膜修复兔腹壁缺损的实验研究中文摘要脂肪干细胞复合牛心包膜修复兔腹壁缺损的实验研究中文摘要【背景和目的】近年来，组织工程技术在女性盆底重建外科学的研究中得到了越来越多的应用，是女性盆底重建外科学的一个重要的发展领域。本论文针对目前盆底重建手术面临的一些侵蚀（erosion）、性交痛(dyspareunia)、暴露(exposure)、收缩(shrinkage)、瘘管

2、（fistula）等术后并发症问题，构建一种脂肪干细胞（adipose-derivedstemcells，ADSCs）复合脱细胞牛心包膜（acellularbovinepericardium，ABP）的新型网片，并将其用于修复兔腹壁缺损模型，探索组织工程技术在女性盆底重建中的应用，为女性盆底重建的研究提供新思路。【方法】1、兔ADSCs的分离培养、鉴定及标记：（1）使用酶消化法、差速贴壁法取兔腹股沟区脂肪组织体外分离培养兔脂肪干细胞，每日在显微镜下观察记录其增殖特征及形态特点；（2）流式细胞仪鉴定第3代脂肪干细胞的表面标记物并分别行成脂、成骨诱

3、导分化，证明其多向分化能力；（3）取第3代脂肪干细胞，以慢病毒介导的绿色荧光蛋白（pGCFU-EGFP-Lentivirus）转染，转染后48小时倒置荧光显微镜观察EGFP的表达情况；（4）取经pGCFU-EGFP-Lentivirus标记的第5代脂肪干细胞，利用流式细胞技术检测pGCFU-EGFP-Lentivirus的转染率。2、交联ABP的制备：交联ABP由上海欣吉特生物科技有限公司提供。行HE染色观察其脱细胞效果及组织结构。3、组织工程生物活性补片的构建：（1）将经pGCFU-EGFP-Lentivirus标记的第5代兔ADSCs接种于

4、脱细胞牛心包膜上，I中文摘要脂肪干细胞复合牛心包膜修复兔腹壁缺损的实验研究荧光显微镜观察细胞的生长情况；（2）MTT法检测脂肪干细胞在脱细胞牛心包膜上的增殖情况。4、兔腹壁缺损模型的建立及补片性能的评估：（1）于12只成年雌性新西兰大白兔腹壁制作腹壁缺损模型，根据不同的处理方式分为以下4组：实验组（将复合兔ADSCs的交联ABP植入兔腹壁缺损处）；交联ABP植入+干细胞注射组（将交联ABP植入兔腹壁缺损处后ABP下注射干细胞）；交联ABP植入组（单纯交联ABP植入）；空白对照组（腹壁缺损处不作任何处理）；（2）分别于移植后第1、2、3月取出移植

5、物行组织学观察评价宿主的炎症反应及兔ADSCs复合交联ABP的生物相容性；行荧光显微镜观察兔腹壁缺损处绿色荧光蛋白的表达情况；行拉力试验研究生物活性补片植入后的生物力学性能。【结果】1、传代培养的兔ADSCs形态较为均匀，呈旋涡状、辐射状排列，体外增殖稳定快速。流式细胞仪检测示CD29、CD90、CD105表达阳性，CD34表达阴性，油红O及茜素红染色均为阳性。2、HE染色显示牛心包膜的细胞基本脱去，呈由染成红色的胶原纤维组成网格状结构。3、pGCFU-EGFP-Lentiviru转染兔ADSCs48小时后，荧光显微镜可观察到EGFP高表达。流

6、式细胞仪检测示pGCFU-EGFP-Lentivirus的转染率达78%左右。此外，荧光显微镜观察示ADSCs在ABP上黏附生长良好，MTT示细胞增殖能力与未接种于脱细胞牛心包膜的ADSCs无明显区别。4、所有动物均未发生补片侵蚀。实验组和交联ABP+干细胞注射组移植后各个时间点的移植物皱缩及粘连均显著小于单纯交联ABP植入组。荧光显微镜观察示植入后的各个时间点实验组和交联ABP+干细胞注射组均可观察到EGFP表达，EGFP的表达量未见明显差别，且随着时间的推移EGFP的表达量均未见明显减弱。组织学观察示实验组和交联ABP+干细胞注射组的生物相

7、容性均优于单纯交联ABP植入组，而实验组与交联ABP+干细胞注射组之间无明显差别。5、拉力试验发现植入后各个时间点含有交联ABP的各个组的断裂拉伸应力参数均高于空白组，而实验组及交联ABP+干细胞注射组的断裂拉伸应力参数则高于单纯交联ABP植II脂肪干细胞复合牛心包膜修复兔腹壁缺损的实验研究中文摘要入组。随植入时间的延长，各个组的断裂拉伸应力参数均逐渐增高。【结论】兔ADSCs是一种理想的组织工程种子细胞，其与交联ABP体内、体外复合所构建的组织工程活性补片均有助于腹壁组织缺损的修复，可进一步应用于女性盆底重建。【关键词】兔脂肪干细胞；脱细胞牛

8、心包膜；组织工程；盆腔器官脱垂；盆底重建作者：许培荣指导教师：吴氢凯III英文摘要脂肪干细胞复合牛心包膜修复兔腹壁缺损的实验研究ABSTRACTRep