脂肪源干细胞修复兔膝关节全层软骨缺损研究

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1、脂肪源干细胞修复兔膝关节全层软骨缺损研究.L.编辑。【摘要】观察评价兔膝关节髌股关节面中心人工制造全层关节软骨缺损后，单纯脂肪源干细胞复合海藻酸钙凝胶移植到软骨缺损处对关节全层软骨缺损的修复效果，以探索关节软骨缺损修复简单有效的途径。［方法］新西兰大白兔27只随机分为A、B、C三组，A组关节软骨缺损处置入海藻酸钙凝胶，B组软骨缺损处不做任何处理，C组缺损处置入未经诱导的脂肪源干细胞复合海藻酸钙凝胶，分别于术后第4、8、12周处死动物，通过大体、组织切片观察以及透射电镜等技术手段对修复效果进行观测，采用改良的in［1］等从人脂肪组织悬液中第一次分

2、离获得了多向分化干细胞。目前已证实脂肪组织来源干细胞（adiposederivedstemcells,ADSCs）能向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌肉细胞及心肌细胞定向诱导分化［2］。本实验将单纯脂肪源干细胞复合藻酸钙凝胶载体填充修复兔膝关节全层软骨缺损，对实验结果进行观察分析，以探讨单纯脂肪源干细胞应用于关节软骨缺损修复的可行性，为关节软骨缺损修复探索简单有效的途径。1材料和方法1.1实验材料1.1.1主要仪器(1)超净工作台(JHT-DDC型，济南康宝净化设备有限公司)；(2)恒温孵育箱(Heraeus公司，德国)；(3)倒置相差显微镜(

3、NikonTE2000，日本)；(4)50ml培养瓶(Corning公司，美国)；（5）低温高速离心机（Heraeus公司，德国）。1.1.2主要试剂(1)DMEM培养基(Gibco公司，美国)；(2)Ⅰ型胶原酶(Sigma公司，美国)；(3)胰蛋白酶(上海华美公司，中国)；(4)胎牛血清(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)；(5)D-Hank’s平衡盐（Sigma公司，美国）；（6）海藻酸钠（上海化学试剂站分装厂）；（7）氯化钙（上海生工生物工程有限公司）。2实验方法2.1脂肪源干细胞的获取、培养和鉴定将新西兰大白兔致死，无菌取双侧髂窝处脂肪

4、组织约10ml，用2倍体积D-Hank’s平衡盐液漂洗3遍，剪成1mm×1mm×1mm大小，加入0.2%Ⅰ型胶原酶5ml置于37℃温箱内消化0.5h，低温高速离心机内1000r/min离心10min弃上清，加入160mmol/LNH4Cl约5ml裂解红细胞10min，筛网过滤，按8000个/cm2种植于50ml培养瓶中。培养瓶置于37℃体积分数为5%的CO2恒温孵育箱内。24h后首次换液，去除残余红细胞及未贴壁细胞，后每隔2～3d换液一次，融合达80%以上时传代，动物实验用细胞传至第4代。取部分2代细胞采用含10%FBS，0.1μmol/L地塞

5、米松，50μmol/L维生素C，10mmol/Lβ-甘油磷酸钠，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素的DMEM诱导培养基向成骨细胞方向诱导。2.2动物实验选择健康成年新西兰大白兔27只（购自山东鲁抗实验动物中心），体重2.5～3.5kg，雌雄不限。编号后随机分成A、B、C3组，每组9只，双膝均用于实验。10%水合氯醛耳缘静脉麻醉，取双侧膝关节内侧切口，将髌骨推向外侧，进入关节腔。分别于左右两侧用直径3.5mm的钻头在髌股关节面中心造成全厚关节软骨缺损，深度以点状出血为止，约2.5mm。A组：（18膝）缺损处单纯置入海藻酸钙凝胶。B组：（1

6、8膝），空白对照，缺损处不作任何处理。C组：（18膝），置入培养的脂肪源干细胞／海藻酸钙凝胶复合物，细胞最终浓度不低于2.0×106／ml。术毕兔清醒后，放置笼内自由活动，青霉素肌注连续5d。2.3检测方法2.3.1细胞学检测生物学特性观察：观察细胞生长情况；取部分2代细胞制成细胞爬片做油红O染色；另取部分向成骨细胞方向诱导的2代细胞制成细胞爬片做VonKossa染色观察矿化结节，以证实所培养细胞有无干细胞特性。2.3.2修复组织检测分别于术后4、8、12周处死动物，取材行大体、光镜组织学检查及电子显微镜下观察。(1)大体观察：膝关节滑膜有无充

7、血水肿，关节囊有无粘连及修复组织的平整度、光泽度；(2)组织学检测：将标本脱钙、梯度酒精脱水，常规石蜡包埋、切片，HE染色和甲苯胺兰染色，进行光镜下组织学观察；（3）透射电镜观察：取12周修复组织，包埋后超薄切片，观察细胞及基质情况。2.4统计学分析根据改良的Wakitani评分标准(见表1)采用盲法对各标本进行组织学评分。每一标本均有3人进行评分，取均数，所得评分结果应用SPSS11.5统计软件进行多因素方差分析，与对照组比较采用Dunt检验。表1软骨缺损修复的组织学评分标准指标组织学表现评分3结果3.1脂肪源干细胞培养及诱导细胞于接种后24

8、h左右开始贴壁，细胞形态呈长梭形、三角形或多角形（图1）。细胞生长旺盛，3～4d即可传代。取部分2代细胞制成细胞爬片做油红O染色，苏木素复染细胞核，胞