应用脂肪干细胞修复猪膝关节软骨缺损的实验研究

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1、上海交通大学硕士学位论文应用脂肪干细胞修复猪膝关节软骨缺损的实验研究姓名：伍耀豪申请学位级别：硕士专业：外科学整形外科指导教师：崔磊20070401上海交通大学硕士学位论文应用脂肪干细胞修复猪膝关节软骨缺损的实验研究摘要各种原因造成的关节软骨损伤性疾病在修复重建外科中很常见。由于软骨自身结构的特殊性，关节软骨的自我修复能力非常有限，损伤后的关节软骨一般由纤维组织或者纤维软骨所修复。目前常用的软骨或人工代用品移植修复等方法均存在许多问题,不能修复重建关节软骨原有的透明软骨结构。自体软骨细胞移植修复软骨缺损是效果比较肯定的一种治疗方法，但是自体软骨细胞移植也存在如细胞供区不足、体外培养周

2、期长、供区易发生病变和软骨细胞表型不易保持等缺点。因此，这一方法的使用受到了限制。组织工程的兴起与发展为软骨缺损的治疗提供了新的思路和方法。脂肪干细胞（Adipose-DerivedStemCells,ADSCs）是间充质干细胞（MesenchymalStemCells,MSCs）中研究较多的种子细胞之一。有大量的研究表明脂肪干细胞在体外特定条件下，能够向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和神经细胞等分化。同时，Zuk等对脂肪干细胞的软骨分化能力做了比较全面的研究，指出脂肪干细胞在特定条件下能向软骨细胞诱导分化。但是，应用ADSCs作为种子细胞修复大动物关节软骨缺损的研究罕有报道。ADSC

3、s是否能作为组织工程种子细胞，并用于修复大动物关节软骨缺损，目前尚未明确。因此，我们探讨以自体ADSCs为种子细胞，PGA/PLA为支架材料，应用组织工程方法修复猪膝关1上海交通大学硕士学位论文节软骨缺损的可行性。此外，应用自体ADSCs作为种子细胞，和其它种子细胞一样，仍然会对患者机体造成新的创伤，获取脂肪组织会造成患者疼痛不适，更重要的是患者必须等待一段时间才能得到构建组织的治疗，不能满足急性病患者的需要。因此，探讨应用同种异体成体干细胞作为种子细胞一直是组织工程领域的重要研究方向。我们前期的研究发现同种异体ADSCs具有特殊的免疫学特性，在体外能够抑制混合淋巴细胞反应。但是，成

4、软骨诱导后的同种异体ADSCs是否能够修复大动物关节软骨缺损还有待进一步的研究。因此，我们探讨以同种异体ADSCs为种子细胞，PGA/PLA为支架材料，应用组织工程方法修复猪膝关节软骨缺损的可行性，同时对其免疫学机制进行初步探讨。【目的】探讨应用自体ADSCs和同种异体ADSCs作为种子细胞、PGA/PLA作为支架材料构建组织工程软骨修复猪膝关节软骨缺损的可行性。【方法】1.猪ADSCs体外多向分化潜能的实验研究：对猪脂肪组织中分离的基质细胞观察体外增殖能力，并收集第二代ADSCs分别进行成骨诱导培养、成软骨诱导培养和成脂肪诱导培养，通过免疫荧光检测和RT-PCR检测，观察其多向分化

5、潜能。2.PGA/PLA支架材料与细胞相容性的实验研究：细胞材料复合后应2上海交通大学硕士学位论文用Hoechest方法检测其生长曲线，DiO标记细胞后接种在材料上，观察细胞生长情况；扫描电镜观察细胞材料复合物的粘附情况，细胞材料复合物成软骨诱导后检测GAG含量。3.自体ADSCs修复猪膝关节非负重区软骨缺损的实验研究：以自体ADSCs为种子细胞，以聚羟基乙酸/聚乳酸（PolyglycolicAcid/PolylacticAcid,PGA/PLA）为支架材料，对猪膝关节非负重区软骨缺损进行修复。以自体ADSCs-PGA/PLA复合物为实验组，以单纯的PGA/PLA材料为对照组，术后3

6、、6个月取材，行大体观察、HE染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色和甲苯胺蓝染色观察其修复情况。4.自体ADSCs修复猪膝关节负重区软骨缺损的实验研究：以自体ADSCs为种子细胞，以PGA/PLA为支架材料，对猪膝关节负重区软骨缺损进行修复。以自体ADSCs-PGA/PLA复合物为实验组，以单纯的PGA/PLA材料为对照组，术后3、6个月取材，行大体观察、HE染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色和甲苯胺蓝染色观察其修复情况。5.同种异体ADSCs修复猪膝关节非负重区及负重区软骨缺损的实验研究：以成软骨诱导的同种异体ADSCs为种子细胞，以PGA/PLA为支架材料，对猪膝关节非负重区和负重区软骨缺

7、损进行修复。以同种异体ADSCs-PGA/PLA复合物为实验组，以单纯的PGA/PLA材料为对照组，术后3、6个月取材，行大体观察、HE染色观察修复情况，并检测细胞移植后免疫学相关指标变化。3上海交通大学硕士学位论文【结果】1.猪ADSCs体外多向分化潜能的实验研究：猪ADSCs在体外诱导条件下能够向成骨细胞、成软骨细胞和成脂肪细胞分化。2.PGA/PLA支架材料与细胞相容性的实验研究：细胞生长曲线测定表明细胞在材料上生长良好；DiO标记表明细胞在材料上呈