脂肪干细胞直接修复兔膝关节软骨损伤的实验研究

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1、第二军医大学博士学位论文脂肪干细胞直接修复兔膝关节软骨损伤的实验研究姓名：张勇申请学位级别：博士专业：外科学（骨外）指导教师：赵建宁20090401脂肪干细胞直接修复兔膝关节软骨损伤的实验研究摘要目的：脂肪干细胞由于获得容易，创伤小，数量大等优点成为软骨组织工程中种子细胞研究的热点。但是传统体外诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化常需要生长因子，存在分化不充分和去分化的问题，并且费用昂贵。现发现在体内脂肪干细胞不仅能定向分为成熟细胞，而且还可以分泌细胞因子参与组织修复。因此，直接移植脂肪干细胞修复关节软骨损伤可能更有效。但目前对关节内的微环境特别是其病理微环境能否使脂肪干细

2、胞向软骨细胞定向分化还不明确。有学者发现体外共培养的软骨细胞可以诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化，并构建软骨组织。而对软骨细胞特别是病理状态下的软骨细胞能否诱导脂肪干细胞分化为软骨细胞尚不清楚。因此，本试验拟通过共培养新西兰大白兔骨关节炎模型来源的软骨细胞和脂肪干细胞结合体内实验，探讨脂肪干细胞在关节病理状态微环境里向软骨细胞分化修复软骨损伤的可能性，同时还为体外诱导脂肪干细胞构建软骨组织提供可能的新方法。材料与方法：1、分离培养新西兰大白兔脂肪干细胞；2、油红0染色观察脂肪干细胞的形态；3、生长曲线测定冻存前后脂肪干细胞的增殖率；4、体外诱导脂肪干细胞向成骨细胞

3、和软骨细胞分化，并分别用yonKossa染色和甲苯胺蓝染色检测；5、分离培养原代新西兰大白兔骨关节炎模型的脂肪干细胞和软骨细胞，分别种植于六孔板和插入式细胞培养皿。根据不同血清浓度(IO％FBS和2％FBS)和不同空间(纤维蛋白凝胶支架和无支架单层培养)分组，共培养14d后，胰酶消化终止；6、倒置显微镜和电镜观察共培养后脂肪干细胞的形态变化；7、分别用免疫细胞化学和甲苯胺蓝染色法检测共培养后脂肪干细胞的II型胶原和蛋白多糖的表达水平；8、RT—PER检测蛋白多糖、II型胶原、I型胶原和X型胶原的基因转录水平；9、分为脂肪干细胞一支架组和单纯支架组修复兔股骨髁负重关节

4、面软骨全层的新鲜和陈旧性损伤，分别于术后6周和12周取材，大体观察和组织学评价。结果：1、从兔脂肪组织中提取的脂肪干细胞冻存前后体外均增殖迅速，成纤维细胞样生长并具有成骨和成软骨的能力；2、共培养7d后部分脂肪干细胞变圆，14d时脂肪干细胞形态高度分化与成熟软骨细胞相似，其蛋白多糖和II型胶原的基因转录和蛋白表达均增高，尤以IO％FBS支架共培养组最为明显，但各组均发现有I型胶原基因的转录，而未发现X型胶原基因转录；3、对于新鲜和陈旧性关节软骨损伤，脂第二军医大学博士学位论文肪干细胞一支架组的治疗效果均好于单纯支架组。结论：1、分离培养的脂肪干细胞增殖活性高，具有多

5、向分化能力。而且，冻存后仍能保持增殖活性，可能是软骨组织工程中良好的种子细胞。2、病理状态的软骨细胞可以诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化，其机制可能是通过分泌某些可溶性细胞因子来发挥诱导作用。提示脂肪干细胞在体内关节病理微环境中可能会向软骨细胞分化。3、高浓度血清三维培养有利于与软骨细胞共培养的脂肪干细胞向软骨细胞分化，在体外构建软骨组织。4、体内直接移植异体脂肪干细胞可以使脂肪干细胞向软骨细胞分化修复关节软骨损伤。关键词：脂肪干细胞，种子细胞，组织工程，软骨，修复脂肪干细胞直接修复兔膝关节软骨损伤的实验研究AbstractObjective：Becauseadipos

6、e-derivedstemcells(ADSCs)callbeeasilyobtainedinlargequantitiesandwithminimaldiscomfort，therehasbeenincreasedinterestinADSCsforcartilagetissueengineering．ButdudngchondrogenesisfromADSCsbytraditionalmethodsusinggrowthfactors，inadequatedifferentiationandhypertrophicdifferentiationaretwoim

7、portantlimitations．Furthermore，thesemethodsareexpensive．Recently,microenvironmenthasbeenproventodirecttheprogressionofADSCsintodifferentiatedcellsinvivo．Andinadditiontomultilineagedifferentiation，ADSCscouldsecretecytokinestorepairdamagedtissue．SothetransplantionofuninducedADSCsdirect