转基因组织工程软骨修复兔膝关节软骨全层缺损

《转基因组织工程软骨修复兔膝关节软骨全层缺损》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、中山大学博士学位论文转基因组织工程软骨修复兔膝关节软骨全层缺损Transgenictissueengineeredcartilageforrepairrabbitfull—thicknessarticularcartilagedefects专业：外科学学位申请人：卢华定指导老师：蔡道章教授论文答辩委员会主席：糊委员：，．籁鹰破中山大学附属第三医院骨科广州中国2005年5月中山大学博上论文中文摘要转基因组织工程软骨修复兔膝关节软骨全层缺损专业外科学博士研究生卢华定导师蔡道章教授摘要一研究背景及目的由创伤、骨关节炎等引起的关节软骨病损是骨科常见疾患，己成为导致中老年人残疾的主

2、要原因。局限于软骨浅层的钦损，依靠软骨细胞有限的分裂能力仅有微小的内源性修复或难以修复；全层关节软骨缺损．由骨髓迁徙来的间充质干细胞分化为软骨细胞，形成的新生修复组织介于纤维软骨和透明软骨之间，其性能难与正常软骨相比，逐渐出现退变。近年来探索应用于临床的许多方法，如钻孔术、关节镜下磨削及灌洗术、自体或异馋组织(骨膜、软骨膜、骨软骨块等)移植、细胞(软骨细胞或间充质干细胞)移植等，虽在近期能获得症状的改善，但未能使受损的软骨在形态学、生化和生物力学方面恢复至正常，修复组织不能达到良好的远期疗效，常在短期内发生退变。诸多尝试说明在接受关节置换之前尚无公认的有效手段。组织工程技

3、术可以通过获取自体或异体少量组织细胞，在某些细胞因子的作用下，经体外培养扩增后与支架材料复合，构建与病损区形状结构、生物学特性相近的细胞一支架复合体，以修复或替代损伤组织。以自体软骨细胞为种子细胞，存在来源有限，体外多次传代培养易使细胞发生“去分化”，丧失分泌软骨基质的能力，因此难以用少量自体组织经培养获得大量有正常功能的软骨细胞。干细胞如胚胎干细胞和骨髓基质干细胞具有很强的分裂增殖能力及多向分化潜能，在一定条件下可以分化为软骨细胞，但体外培养条件下如何诱导千细胞向软骨细胞表型分化，以及如何维持软骨细胞表型稳定等目前尚未明确。同种异体软骨细胞具有来源广泛，可以一次性获取大

4、量细胞等优点．在三维立体中山大学博士论文中文摘要培养环境下可保持软骨细胞分化特性，根据以往实验证实异体软骨细胞移植不发生严重免疫排斥反应，显示同种异体软骨细胞可以作为软骨组织工程的种子细胞。理想的支架对于成功构建组织工程软骨也至关重要。天然材料具有良好的细胞和组织相容性，但因初始机械力学强度不足现已较少使用，人工材料具有易加工、降解速率可调节、力学性能好、来源稳定等优点，但是一般人工合成的可降解材料具有较强疏水性的表面，而且其表面缺乏细胞可以识别的位点，因而普遍不具有良好的细胞相容性。将天然材料与人工材料以一定的方式结合起来，制成合成的多孔支架，以使两者的优点相结合，可望

5、制得较理想的软骨组织工程支架。为成功构建工程软骨，需要促进软骨细胞的增殖、维持细胞的表型、增进胞外基质的合成，己证实有多种细胞因子如TGF．B、bFGF、IGF、HGF等能促进软骨形成或刺激细胞增殖。近年来BMP7被发现能维持软骨细胞的表型，诱导软骨细胞外基质如蛋白多糖和II型胶原的合成，并抑制由白介素一1(interleukin一1，lL．1)介导的软骨基质分解代谢。BMP7还能使体外培养中已经表现反分化的软骨细胞恢复表型，重新表达软骨细胞特异性物质。但外源性BMP7来源有限、半衰期短，易被创伤局部的蛋白酶所水解，且治疗剂量相对较大，有可能导致毒性作用的产生限制了其应用

6、。采用转基因技术将BMP7因子的eDNA转染软骨细胞，可使之在体内一定时间内持续表达内源性BMP7，以维持软骨细胞的成软骨生物学性状。本实验研究拟选用幼兔的关节软骨细胞为种子细胞，在体外不同培养条件下观察软骨细胞的生物学性状变化；通过构建携带重组人BMP7eDNA的质粒DNA，转染体外培养扩增的软骨细胞；同时采用I型胶原和羟纂磷灰石复合，构建柱状分层的支架；将软骨细胞种植其中培养，构建小型组织工程软骨复合体，观察植入动物体内修复膝关节软骨缺损的转归。二实验方法与结果第一部分不同培养条件下软骨细胞生物学性状的变化方法：I型胶原支架通过以下步骤制作：将EDC按比例加入I型胶原

7、溶液中混合，倒入制作好的模具内，4"C静置24h．．80。C冷冻lh后脱模，再在冷冻干燥机中1I中山大学博士论文中文摘要处理12h，得到I型胶原支架。应用序列酶消化法白2周龄新西兰大白兔膝关节软骨组织中分离软骨细胞，单层培养扩增。通过细胞生长曲线的测定，流式细胞仪检测细胞DNA周期，透射电镜检测，以及II型胶原、S-100免疫组化染色检测软骨细胞在体外单层培养条件下的生物学性状变化；将生长状态良好的第2代细胞消化离·Ii,，接种于I型胶原支架三维立体培养3周，经相差倒置显微镜、扫描电镜、组织学和免疫组织化学检测软骨细胞在胶原支