开口箭中甾体皂苷诱导hl-60和hepg2细胞自噬与凋亡的机制研究

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1、分类号：___________密级：__________UDC：___________开口箭中甾体皂苷诱导HL-60和HepG2细胞自噬与凋亡的机制研究姓名：易晓敏学号：2111540008院系：药学院学位类型：学术学位专业：天然药物化学研究方向：天然活性成分的作用机制导师：何祥久教授论文提交日期：年月日论文答辩日期：年月日学位授予单位：广东药科大学二〇年月ApoptosisandPro-DeathAutophagyInducedbySpirostanolSaponinIsolatedfromTupistrachinensisBakeronHL-60andHepG2cells

2、Candidate:YiXiaominStudentID:2111540008Affiliation:SchoolofPharmacyAcademicDegreeApliedfor:MasterofMedicineSpeciality:MedicinalChemistrySupervisor:Prof.HeXiangjiuDayofDefence:May2018Degree-Conferring-Institution:GuangdongPharmaceuticalUniversity2018广东药科大学硕士研究生学位论文开口箭中甾体皂苷诱导HL-60和HepG2细胞自噬与凋

3、亡的机制研究摘要开口箭（TupistrachinensisBaker）是我国传统药用植物，对多种肿瘤细胞具有显著的细胞毒作用，甾体皂苷是开口箭的主要活性成分，然而其甾体皂苷类化合物的抗肿瘤作用的分子机制尚不明确。研究开口箭中甾体皂苷类化合物对肿瘤细胞的凋亡以及自噬两种程序性死亡的作用，阐明其抗肿瘤作用的分子机制，对于开口箭的进一步开发具有重要意义。本实验研究旨在阐明从开口箭中分离得到的其中一个甾体皂苷类化合物5β-spirost-25(27)-en-1β,3β-diol-1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-xylopyranosyl-3-O-α

4、-L-rhamnopyranoside（SPD）抑制人肝母细胞瘤HepG2细胞和人急性髓性白血病HL-60细胞增殖的分子机制。在前期研究基础上，本研究采用人肝母细胞瘤HepG2细胞和人急性髓性白血病HL-60细胞作为研究对象，用MTT法检测SPD对细胞存活率的影响（阳性对照为顺铂），用AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况，流式细胞术观察细胞周期分布变化，用JC-1染色法检测线粒体膜电位的变化，利用Westernblot法分析线粒体通路上凋亡相关蛋白（PARP、caspase-3、caspase-9、Bax和Bcl-2等）的表达情况，阐明SPD诱导细胞凋亡的分

5、子机制。另一方面，本研究运用MDC染色法初步确定细胞自噬的发生，对HepG2细胞进行GFP-LC3质粒的转染，在荧光显微镜下观察自噬标志性蛋白LC3-III广东药科大学硕士研究生学位论文的聚集从而确认自噬的发生，通过Westernblot技术分析自噬相关标志性蛋白（p62、Beclin-1和LC3）的表达情况，以及自噬经典通路Akt/mTOR/p70S6K信号通路中下游关键蛋白的表达变化情况，阐明SPD诱导细胞发生自噬作用的分子机制。为进一步研究自噬与细胞凋亡、自噬与细胞死亡之间的相互关系，本研究采用自噬抑制剂Baf-A1联用SPD，利用MTT法检测细胞增殖情况；通过West

6、ernblot法检测凋亡相关主要蛋白的表达情况，阐明SPD诱导的细胞自噬在细胞凋亡以及细胞存活中的作用。实验结果表明，开口箭中的甾体皂苷SPD能显著抑制肿瘤细胞的增殖，对细胞增殖的抑制作用呈剂量依赖和时间依赖性。对HL-60细胞和HepG2细胞分别作用48h，IC50分别为2.0±0.2μM和7.4±0.1μM；阳性对照（顺铂）IC50分别为4.7±0.6μM和6.5±0.3μM，SPD对HL-60细胞表现出更显著的细胞毒作用。AnnexinV-FITC/PI双染、荧光显微镜下观察HepG2细胞凋亡情况发现，随着药物浓度的增加，视野内绿色荧光和红色荧光均随之增多，直观地说明早

7、期凋亡和晚期凋亡的HepG2细胞随药物浓度增加而逐渐增多。流式细胞术检测细胞凋亡结果显示，4和8μM的SPD作用于HL-60细胞，或者8和10μM的SPD作用于HepG2细胞时，能显著的提高细胞凋亡率；2μM的SPD作用于HL-60细胞和HepG2细胞，12h即可显著提高凋亡率，36h早期凋亡率达到最高，晚期凋亡率随作用时间增加而不断增大，72h时达到最高，说明SPD能诱导HL-60细胞和HepG2细胞发生凋亡。流式细胞术检测细胞周期分布结果表明，SPD能阻滞HL-60细II广东药科大学硕士研究生学位论