花生过敏原蛋白arah1纯化和表达的研究论文

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1、南昌大学硕士学位论文花生过敏原蛋白Arah1的纯化与表达研究姓名：闫飞申请学位级别：硕士专业：生物化工指导教师：吴志华20120607摘要摘要花生是世界八大类过敏食物之一，并且由于花生过敏反应具有长期性、普遍性、严重性等特点，已引起全球范围内的广泛关注。现阶段，人们已经发现了11种花生过敏原蛋白，其中Arah1蛋白含量最高，且被90％的花生过敏患者的血清所识别，是花生主要过敏原之一。因此，本文的主要研究工作围绕Arah1展开。论文主要工作包括从花生种子中分离纯化天然过敏原Arah1、兔抗天然Arah1蛋白多克隆抗体的制备、Arah1基因的克隆、重组A

2、rahl的原核表达与纯化。研究的主要方法与结论如下：1．先后采用DEAE。SepharoseFastFlow阴离子交换层析、Superdex200凝胶层析及ConASepharoes4B亲和层析等三步分离纯化花生过敏原Arah1，并利用MALDI．TOF／MS对所分离的蛋白进行鉴定。结果表明，本方法可分离纯化得到纯度为90％以上的天然Arah1，提取得率为43毫克／10克花生。2．以纯化的天然Arah1为抗原，免疫新西兰大白兔，获得兔抗Arah1多克隆抗体，通过ELISA和免疫印迹方法检测其效价和特异性，结果表明，该抗体效价达1：200，000，且不

3、与花生中其他蛋白发生交叉反应，能够满足后续实验的需要。3．利用SVTotalRNAIsolationSystem试剂盒从花生种子中提取花生总RNA，采用RT-PCR技术扩增获得花生过敏原Arah1基因，并将其克隆入pMDl8一TSimpleVector载体，再导入E．coliDH50t克隆菌保存。对目的基因进行的序列测定表明，该基因与已报道的Arah1序列具有99％的同源性。4．双酶切重组质粒pMDl8-T-Arah1得到Arahl目的基因，连接至pET-32a表达载体中构建重组质粒pET-32a．Arah1，并将其转化到表达宿主茵BL21(DE3)

4、plysS中，IPTG诱导表达出重组蛋白Arah1，并通过SDS．PAGE与免疫印迹实验进行验证。然后对表达宿主菌进行不同IPTG浓度、不同摇床转速、不同诱导温度和时间等条件的优化，获得重组蛋白Arah1可溶性表达的最佳条件为：IPTG浓度0。3mmol／L，摇床转速160rpm，诱导温度24。C，诱导时间为8h。最后通过亲和纯化的方法获得重组蛋白Arah1。关键词：花生过敏原；Arah1：分离纯化：多克隆抗体；原核表达AbstractABSTRACTPeanutisoneoftheeightmostcommonallergy—causingfood

5、s．Generally,peanutallergyissevere，widespreadandtypicallypermanent，whichhadbecomeapublichealthissueandfoodsafetyproblemwithanincreasingattention．Uptodate，1peanutallergenswerereported．Amongthem，Arah1isanimportantallergenasrecognizedbymorethan90％peanut—allergicindividualserumIgE．T

6、herefore，itisnecessarYandsignificanttocarryoutthereseachonArah1．ThepresentresearchiscomposedofseveralpartsincludingthepurificationofArahlfromnaturepeanut，preparationofrabbitantiArah1polyclonalantibody,cloningandprokaryoticexpressionofrecombinantArah1，andpurificationoftherecombi

7、nantArah1．Majormethodsandconclusionswerelistedasfollowing：1．Arah1Waspurifiedfromnaturalpeanutseedsthroughathree—steppurificationmethodbythreechromatographies：firstlyDEAE—SepharoseFastFlowanionexchangechromatography,thenSuperdex200gelfiltrationchromatographyandatlastConASepharoe

8、s4Baffinitychromatography．ThenthepurifiedArah1wasident