经尾静脉注射移植人脐带间充质干细胞治疗大鼠缺血性脑卒中的实验研究

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1、中图分类号UDC硕士学位论文学校代码密级10533经尾静脉注射移植人脐带间充质干细胞治疗大鼠缺血性脑卒中的实验研究StudiesofHumanUmbilicalCordMesenchymalStemCellsIntravenousInjectiveTransplantationviaVenaCaudalisinRatswithIschemic作者姓名：曾瑛学科专业：临床医学研究方向：影像医学与核医学学院(系、所)：湘雅二医院指导教师：刘平教授副指导教师：罗建光教授论文答辩日期兰竺堕垒!!答辩委员会主席中南大学二。一三年五月原创性声明I

2、IIIIIIIrlllllllllUllIJIlllllJIIIlUfY2425012本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：＼鎏盔日期：兰生年j月』日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送

3、交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。～／v1作者签名≥豸鑫玉一导师签名日期：旦年三月上日经尾静脉注射移植人脐带间充质干细胞治疗大鼠缺血性脑卒中的实验研究摘要目的：体外培养原代人脐带间充质干细胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells，hUMSCs)，并对其进行传代扩增，观察及鉴定其生物学特性，经尾静脉注射移植

4、hUMSCs治疗缺血性脑卒中，探讨其作用机理并且提供理论依据及实验基础。方法：取足月妊娠健康新生儿脐带，PBS充分冲洗，剔除脐带血管及羊膜，将华通胶(Wharton’S．jelly)剪碎至lmm3大小，将组织植入培养皿中，在含有10％胎牛血清(fetalbovinesenun，FBS)、10ng／ml碱性成纤维生长因子的DMEM／F12中培养，观察细胞形态变化，细胞融合至80％-90％后原代细胞培养完成，进行消化传代。收集P5代细胞，流式细胞仪检测细胞表面表型，包括FITC—CD29、FITC—CD44、FITC—CD34、FITC．

5、CD45、FITC．CD105、CDl06、FITC．mA．DR等，并以FITC标记的二抗IgG作为同型对照。动物模型：选取左侧大脑中动脉栓塞再灌注模型(MiddleCerebralArteryOcclusion．MCAO)，选取重量250～2809之间的雄性成年SD大鼠作为实验动物，待麻醉后取颈部正中切口，从颈总动脉结扎远端插入0．26mm尼龙线头约1．8cm，末端置于左侧大脑中动脉开口处，2小时后拔出尼龙线再灌注，同时设立对照组，对照组不插入尼龙线。术后24小时行改良神经功能评分(modifiedneurologicalsever

6、ityscore，mNSS)，并进行MRI检查及TTC染色，观察梗死的情况。选取mNSS评分在7～12分的大鼠随机分组：(1)hUMSCs移植组n=17，细胞移植量3×106；(2)磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferedSaline，PBS)对照组，n=13。造模后24小时进行移植，经大鼠尾静脉注入CM．Dil标记的hUMSCs细胞悬液，术后1、7、14、21、28天对所有大鼠进行mNss评分，并将大鼠处死，行全脑连续冰冻切片，检测CM—Dil标记的移植细胞在缺血梗死脑组织中存活情况。采用SPSS统计学软件对实验数据进行统计

7、分析。结果：组织块接种5天左右可见少量梭型成纤维样细胞爬出，7天可见小细胞集落形成，12至14天细胞可见大量生长，达到90％汇合程度，原代细胞培养完成。P1代细胞按1：1细胞传代，以后细胞可根据细胞数量1：2～1：3传代。传代后数十分钟后可见细胞迅速贴壁，2至3天可见细胞80～90％左右达到融合，并可见细胞呈旋涡状生长。流式细胞检测显示细胞强表达表达CD29、CD44、CDl05，不表达CD34、CD46、CDl06及HLA．DR。MCAO移植后神经功能评分证明PBS组大鼠在移植后1至14天主要在反应性、平衡感较MSC组差，神经功能评

8、分有统计学差异(PO．05)。实验组移植后7天行大鼠大脑冰冻切片，能在缺血区域找到红色荧光标记的移植细胞。结论：本实验证实了人间充质干细胞在脐带中含量丰富，且能在