线粒体损伤在重症休克中作用及虎杖苷治疗

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1、南方医科大学2010级博士学位论文线粒体损伤在重症休克中作用及虎杖苷治疗TheroleofmitochondrialinjuryinsevereshockandtreatmentofPolydatin课题来源：国家自然科学基金(30971202)国家科技重大专项(2011ZX09101．002．08)学位申请人王兴民导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院赵克森教授病理学与病理生理学学术型博士基础医学院2013年5月15日广州博士学位论文线粒体损伤在重症休克发生中的作用及虎杖苷治疗博士研究生：王兴民指导教师：赵

2、克森教授摘要重症休克患者有很高的死亡率，在输血补液等一般抗休克治疗后生命仍难以纠正。导致重症休克高死亡的原因很复杂，目前仍然不清楚，因此查明导致高死亡率的发病机制对临床上指导重症休克的治疗具有重要的意义。我们的前期实验证实，血管平滑肌细胞(ASMCs)ATP含量下降，激活ATP敏感性钾通道，促使细胞膜超极化和L型钙通道抑制，导致血管对去甲肾上腺素的反应性下降和顽固性低血压。在这种急性重症休克条件下(失血到MAP30mmHg2小时，回输血液2小时)，除了微循环障碍带来血管平滑肌细胞(ASMCs)氧气和营养物质供应

3、不足以外，还查明血管平滑肌细胞线粒体损伤带来ATP的合成障碍引起低血管反应性和顽固性低血压。重症休克是一个全身性缺血．再灌注损伤，它导致线粒体器质性损伤可能是急性休克晚期一个体内普遍存在的现象，参与了重症休克难治期(微循环衰竭期)的发生。为了证实以上设想，本研究对重症休克大鼠的血管平滑肌细胞、大脑神经元和肝细胞的线粒体功能进行了系列研究，从线粒体结构、功能、代谢及损伤机制方面查明线粒体功能不全在重症休克发病中的作用。本研究的另一个目的是查明新的线粒体保护剂，并使用线粒体保护剂从实验治疗的角度，确证线粒体损伤在重

4、症休克发生中的作用。白藜芦醇和环孢霉素A是国际公认的线粒体保护剂。白藜芦醇通过螯合氧化反应所需的二价铁抑制氧化摘要应激，又能够抑制线粒体复合物III减少氧自由基生成，发挥保护线粒体的作用。和白藜芦醇一样，环孢霉素A通过作用于亲环素D抑制线粒体通透转变孔开放发挥保护线粒体的作用。虎杖苷(Polydatin，PD)Ij勺化学名称是白藜芦醇苷(白藜芦醇结合了一个分子的葡萄糖)，因此虎杖苷很有可能具有线粒体保护的作用。本研究一方面用三种线粒体保护剂的保护效应进行相互比较，另一方面用三种脏器细胞的变化与全身休克抢救效果相

5、互对照，查明线粒体保护剂对重症休克治疗的重要性，为临床重症休克的治疗提供新途经。第一部分血管平滑肌线粒体功能不全在重症休克中的作用一、重症休克时血管平滑肌细胞发生了线粒体损伤l，重症休克时血管平滑肌细胞线粒体超微结构损伤：透射电镜结果显示假手术组血管平滑肌细胞线粒体呈现椭圆状，嵴结构完整，但是在休克组线粒体呈圆球状，嵴断裂空泡化，明显肿胀，提示重症休克时血管平滑肌细胞细胞线粒体超微结构损伤。2．重症休克时血管平滑肌细胞线粒体内膜跨跨膜电位降低：采用JC．1荧光探针流式细胞仪测定线粒体跨膜电位。休克组线粒体去极化

6、的血管平滑肌细胞为80．34士9．01％，明显高于假手术组的13．44士7．73％(尸=0．000)，提示重症休克时血管平滑肌细胞可能存在线粒体质子泵功能损伤或通透转变孔开放，带来跨膜离子梯度的下降。3．重症休克时血管平滑肌细胞ATP含量降低：休克组血管平滑肌细胞ATP含量降低到正常水平(假手术组)的17．61士7．87％(尸=0．000)，提示重症休克时血管平滑肌细胞线粒体功能不全。4．重症休克时血管平滑肌细胞膜KATP的激活和细胞超极化：休克组血管平滑肌细胞膜KATP电流相对假手术组显著增加，在电压为+80

7、mV时，KAllP电流密度由假手术组的7．04-2．2pA／pF增加到休克组的15．74-7．3pA／pF(P=0．001)，提示重症休克时血管平滑肌细胞ATP含量降低。和KATP的变化一样，细胞跨膜电位由假手II博士学位论文术组的．3I．74-5．3mV增加到休克组的．49．74-5．3mV(卢0．000)，显示重症休克时血管平滑肌细胞超极化。5．重症休克时血管平滑肌细胞过氧化脂质(LPO)含量增加：实验结果显示血管平滑肌细胞过氧化脂质从假手术组的10．01-4-1．56nmol升高到休克组的15．00-J：

8、2．23nmol(P=o．ooo)，提示重症休克时血管平滑肌细胞内氧自由基激活。6．重症休克时血管平滑肌细胞溶酶体膜稳定性降低：采用nyul橙摄取技术评价溶酶体稳定性。休克组血管平滑肌细胞溶酶体吖叮橙荧光显著低于假手术组，提示重症休克时血管平滑肌细胞溶酶体膜通透。流式细胞仪定量分析结果显示休克组“苍白细胞”(溶酶体受损的细胞)由假手术组的28．27-4-5．19％增)J晦wJ51．64