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1、106中国兽医学报2008年1月第28卷第1期ChinJVetSciJan.2008Vol.28No.1基因表达系列分析(SAGE)及其在生命科学中的应用1,21311包文斌,陈国宏,束婧婷,吴圣龙(11扬州大学动物科技学院,江苏扬州225009;21安徽农业大学动物科技学院,安徽合肥230036)关键词:基因表达系列分析;差异表达;应用中图分类号:Q789文献标识码:A文章编号:100524545(2008)0120106205随着基因组计划研究的不断深入,人们迎来了(3)将上述样品均匀分成两
2、份分别与接口分子以转录组学(transcriptomics)和蛋白质组学(pro2(adapter)A和B连接,接口分子3′端含有一段特定teomics)为核心内容的后基因组(功能基因组)学时的ⅡS型限制性内切酶(如BsmF1)的识别位点,接代,寻找差异表达基因,揭示基因组在时、空上的表口分子3′端可与NIaⅢ消化产物的粘性末端互补结达及调控模式,成为近年来生命科学研究的重要组合。接口分子的5′端分别含有一段用于PCR扩增成部分,差异表达基因不仅表现为表达基因的种类的引物P1和P2的互补片段;(
3、4)用ⅡS型内切酶(又改变,还表现为基因表达量的改变。为了全面评价称为标签酶,taggingenzyme,酶切位点一般位于识别基因表达的总体状况,亟需建立一套全新的方法系位点后20bp处)处理样品,释放带有接头的SAGE统。随着SAGE技术的建立,不仅能快速全面地分标签(9～13bp);(5)利用DNA聚合酶(Klenow)补平析在特定组织和细胞表达的基因并得到这些基因表SAGE标签的粘性末端,并将这些分别含有接口分子达丰度的数量信息,而且还可以比较不同时、空条件A和B的片段连接成双标签(dit
4、ag)序列;(6)利用下基因表达的差异,具有假阳性率低、可重复性强、PCR扩增双标签序列,再次利用锚定酶NIaⅢ切除实验周期相对较短、大量数据可用于多重比较等诸序列上多余的接口分子,得到尾尾相连的SAGE双多优点,目前成为基因表达定量和定性研究的一种标签,双标签侧翼有锚定酶切点;(7)去除接头的有效工具。SAGE双标签彼此连接成长短不一的多联体,电泳分离后收集大小适中的片段克隆到高拷贝的质粒载体1SAGE的原理和方法中,构建SAGE文库(SAGElibrary);(8)随机挑选SAGE文库中的片
5、段进行测序,并用专门的SAGE软SAGE技术的主要理论依据有3个:(1)来源于件对标签进行分类和计数,生成相应的报告和丰度转录体特定位置的9～13bp的核苷酸序列包含足指标,并与NCBI的SAGEmap、GenBank及dEST等公够的信息,能确定一个转录体,可以作为区别转录体用数据库进行比对,比较SAGE文库标签的类型及的标签(tag);(2)这些分离自不同转录体的标签可丰度,分析其意义。以被串连成一定长度的多联体(concatemer),克隆入载体进行测序;(3)同一标签的重复次数代表该转录
6、2SAGE技术的发展体的表达水平,结合生物信息学方法可以确定表达的基因种类和基因的表达丰度。[1]自1995年,肿瘤分子学家Velualescu等建立SAGE方法的基本步骤为:(1)提取mRNA并将SAGE技术以来,SAGE技术取得了飞速的发展。最其与生物素酰化的寡聚糖核苷酸oligo(dT)混合,纯初的SAGE方法对mRNA的量要求比较高,需要+化出带有polyA的mRNA,以其为模板经逆转录得2.5～5.0μg(相当于250～500μg总RNA),这在一到双链cDNA;(2)用1个序列特异性
7、(专门识别4bp定程度限制了样本较少情况下的应用。Daston等[2]碱基)的锚定酶(anchoringenzyme)如NIaⅢ,消化双将从分离mRNA到释放标签间的所有步骤进行优链释放cDNA序列,而生物素酰化的5′端仍被吸附化,提出了microSAGE方法,不仅简化了操作,而且在链霉亲和素的磁珠(Streptavidin2coatedbeads)上;对RNA的需求仅为原来的1/500～1/5000。Peter[3]等提出了SAGE2Lite方法,利用反转录酶的poly(C)末端转移酶活性及在
8、cDNA合成过程中可以改收稿日期:2006204207作者简介:包文斌(19742),男,讲师,在读博士。变复制模板的特性,在cDNA第1链的合成体系中3通讯作者,E2mail:ghchen@yzu.edu.cn加入3′带有Poly(G)的模板转录寡核苷酸(template©1994-2008ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http://www.cnki.net中国兽医学报2008年1月第28卷第1期
