超大孔聚苯乙烯微球固定蛋白质

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1、第9卷第6期过程工程学报Vol.9No.62009年12月TheChineseJournalofProcessEngineeringDec.2009超大孔聚苯乙烯微球固定蛋白质1,2222122曲瑞芳，孔英俊，曲建波，马光辉，马润宇，苏志国，罗坚(1.北京化工大学生命科学与技术学院，北京100029；2.中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京100190)摘要：采用琼脂糖对孔径为300~500nm的超大孔聚苯乙烯(MPS)微球进行亲水化修饰，并在修饰后的表面上偶联病毒蛋白颗粒(RV)，用于蛋白质的分离纯化实验.结

2、果表明，经过修饰的MPS层析介质具有优异的流体力学性能，层析过程的最高流速可达1120cm/h，对病毒蛋白颗粒的固定量为0.638mg/g，是商品化介质Sepharose4FF的2倍.采用RV−MPS介质对病毒蛋白颗粒抗体进行了分离纯化，收率为29.22%，高于Sepharose4FF的18.92%.关键词：超大孔聚苯乙烯微球；流体力学特性；蛋白质；分离；固定+中图分类号：Q939.9；O658.11文献标识码：A文章编号：1009−606X(2009)06−1164−051前言粒RV由华兰生物工程股份有限公司提供，分子量为生

3、物制药工业的发展对蛋白质的大规模分离纯化1000kDa；病毒蛋白颗粒抗体HRIG(比活0.57IU/mg)技术提出了更高的要求，其中，层析技术是研究的热点由华兰生物工程股份有限公司提供，HRIG活性测定试之一.传统的层析介质以天然多糖为骨架，虽然亲水性剂盒购自武汉生物制品研究所基因工程室.好，但其孔道直径大多为十几纳米，纳米尺度的蛋白质实验所用HCl,NaOH,NaH2PO4,Na2HPO4,NaCl和在其中必然受到传质控制，导致层析速度很慢，常常需醋酸、硼氢化钠、乙醇胺、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、[1,2]缩水甘油苯基醚、

4、环氧氯丙烷、十二烷基硫酸钠、DEAE、要十几到几十小时，蛋白质在纯化过程中易失去活性.因此，传质速度成为蛋白质层析的瓶颈.本实验室采用异硫氰酸荧光素(FluoresceinIsothiocyanate,FITC)等试[3]剂均为分析纯.反胶团溶胀法简便地制备出孔径在300~500nm的超大孔聚苯乙烯(MacroporousPolystyrene,MPS)微球，是2.2实验仪器传统介质孔径的10倍以上，可有效解决流动相传质问ÄKTAPurifier10液相层析系统，Ultraspec2000紫题，具有操作压强低、流速快、适于放大

5、等优点.但外−可见分光光度计(美国GE公司)，Model550酶联免[4]疫检测仪(美国Bio-Rad公司)，TGL-16M高速台式冷冻MPS微球表面有强烈的疏水性，使其对蛋白质的非特异性吸附强，易引起蛋白质变性失活.离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司)，真空冻干机(美[5]国Labconco公司)，LeicaTCSSP2激光共焦扫描显微镜Tuncel等采用亲水性聚合物聚乙烯醇(Polyvinyl[6]系统(德国Leica公司)，XSZ-H5光学显微镜(重庆光电Alcohol,PVA)、Malmsten等采用羟乙基纤维素、Si

6、mon[7]仪器有限公司)，WV-CP230/G显微镜成像装置(日本等采用疏水改性的羧甲基支链淀粉对聚苯乙烯微球表面进行修饰以降低疏水性，虽然很大程度上降低了非特Panasonic公司)，Mastersizer2000激光粒度仪(英国异性吸附，但并未完全消除.为此，本实验室探索了以MalvernInstruments公司)，Qplus超纯水机(美国[8]Millipore公司)，玻璃层析柱200mm×10mmI.D.(上海琼脂糖为修饰剂对MPS微球进行修饰.琼脂糖具有良好的亲水性和螺旋结构，可能会更有效地覆盖微球表面.锦华层析

7、设备厂).本研究采用化学交联法将带有疏水基团的琼脂糖2.3实验方法吸附到MPS微球表面，形成致密的琼脂糖层，然后将2.3.1MPS微球的制备[3]改性后的MPS微球通过共价键偶联病毒蛋白颗粒，制采用反胶团溶胀法制备MPS微球，主要步骤为：备固定化病毒蛋白颗粒的RV−MPS介质，考察了其流在油相中加入表面活性剂十二烷基硫酸钠，将其分散在体力学和分离纯化性能，并与传统层析介质进行了比较.水相中，制成内含表面活性剂的油滴.当油相中的表面活性剂增加到一定量时，油滴内部形成吸水溶胀的表面2实验活性剂连续相.75℃下悬浮聚合20h，形成内

8、部有大量2.1实验材料300~500nm孔道的聚苯乙烯微球.Sepharose4FF介质购自美国GE公司，病毒蛋白颗2.3.2MPS微球的改性收稿日期：2009−06−10，修回日期：2009−07−17基金项目：国家自然科学基金资助项目(编号：20706052)；国家高技术