携带hla-g慢病毒转染大鼠原代培养肝细胞及对抗大鼠肝移植排斥反应的研究

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1、中图分类号R617UDC610学校代码10533博士学位论文携带HLA—G慢病毒转染大鼠原代培养B：F．垒EB胞及对抗大鼠肝移植排斥反应的研究LentivirusmediatedHLA-Ggeneoverexpressioninratprimaryculturedhepatocytesanditseffectofanti．acute●^-●●‘reiectionotratlivertransplantation作者姓名：孙培龙学科专业：临床医学研究方向：外科学学院(系、所)：湘雅三医院指导教师：叶放发教授论文答辩日期至Q!墨生墨旦22旦答辩委员会主席中南大学2

2、013年5月原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：盘基遂；基日期：型!i年』月』上日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采

3、用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。日期：丝年上月4日携带HLA—G慢病毒转染大鼠原代培养肝细胞及对抗大鼠肝移植排斥反应的研究摘要：目的：人类白细胞抗原G(HLA—G)因为在母体胎儿之间的免疫耐受中发挥了关键性作用而被注意，提示它可能应用于器官移植。HLA—G在体外诱导表达已被证实有诱导免疫耐受的特性，移植术后患者体内HLA—G的表达已被证实与移植术后急性和慢性排斥反应发生率降低有关。我们使用转染携带人HLA—G基因的慢病毒转染大鼠原代培养肝细胞及大鼠

4、移植肝脏，在体外及在体条件下探讨HLA-G的表达是否有直接保护移植肝脏免受排斥反应损伤的效果。方法：1、取260只健康雄性SD大鼠，分三个阶段进行，先建立大鼠原位肝移植模型的手术训练和探索。手术熟练后，取40只SD大鼠和40只Wistar大鼠，建立SD至Wistar大鼠肝移植急性移植排斥反应模型。2、建立携带HLA—G的慢病毒表达体系。3、进行SD大鼠肝细胞原代培养。4、将携带人HLA—G的慢病毒转染SD大鼠原代培养肝细胞，转染后7天，通过免疫荧光、RT—PCR和WesternBlot实验进行检测，分别从病毒转染、mRNA水平和蛋白水平全面评价HLA—G慢病毒

5、转染的效果。5、采用kamada二套管法建立SD和Wistar大鼠的原位肝移植模型45例，随机分为三组，每组15例。实验组在SD大鼠的供体肝脏取下后，从门静脉输注2ml包含有i07TU／ml携带HLA—G基因的慢病毒，将携带人HLA—G的慢病毒转染大鼠供肝，与不加任何处理的对照组和术后规律使用FK506的对照组进行对比，对比术后三组肝组织中的HLA—G的表达水平、术后第7天、第14天和第56天的AST和BIL值以及病理切片、术后生存天数。探讨携带HLA-G基因的慢病毒转染供肝，是否可对抗大鼠急性肝移植排斥反应。结果：l、经训练，成功建立SD至Wistar大鼠肝

6、移植急性移植排斥反应模型。2、携带人HLA—G的慢病毒可成功转染SD大鼠原代培养肝细胞。3、转染携带有HLA—G慢病毒的实验组术后7天大鼠的AST和BIL值，与术后使用FK506的对照组差别有显著性(P<0．05)，与术后不加处理的对照组差别有极显著性(P

7、．50天，HLA-G组中位生存时间91．50天，各组之间差别有显著性(P<0．01)。提示这种治疗可延长受体大鼠的存活期。病理切片结果显示，转染携带有HLA—G慢病毒的实验组和术后使用FK506的阳性对照组，术后7天病理切片仅有轻度排斥反应，而术后不加任何处理的阴性对照组则显示为重度排斥反应。术后56天，FK506组病理切片显示存在轻度排斥反应，而HLA—G组无排斥反应。结论：1、转染携带有HLA—G慢病毒作为治疗性的手段用于大鼠肝移植急性排斥反应模型，能有效保护大鼠移植肝的功能和延长存活期。2、体外实验及动物实验均表明，肝细胞对慢病毒介导的基因转移易感，表明

8、慢病毒对肝细胞有很高的转导效率，且转入