hiv-1+gp120对视网膜色素上皮细胞功能影响及其分子机制的研究

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1、∞}04111002带勘采毋博士学位论文H1V-1gpl20对视网膜色素上皮细胞功能影响及其分子机制的研究学位中清人‘一导"姓名噩职雌余秋蓉张振平教授眼科学^”晰叭旺弘m糠呲yHIV-!gpl20对视网膜色素上皮细胞功能影响及其分子机制的研究HIV一1gpl20对视网膜色素上皮细胞功能影响及其分子机制的研究专业：眼科学博士研究生：余秋蓉导师：张振平教授中文摘要I型人类免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiencyVirusType1，HIV-1)引起的获得性免疫缺陷综合征(Acquire

2、dImmunodeficiencySyndrome，AIDS)，即艾滋病，是一种致命性的传染病，艾滋病具有多项合并症，大约50-75％的艾滋病感染者合并有眼部并发症，尸检证实眼底微血管病变发病率可高达8996。AIDS视网膜病(AIDSretinopathy)，又称HIV视网膜病／非感染性HIV视网膜病，疾病发生早、累及人群广泛。病理特点表现为视网膜微血管渗漏、神经节细胞丧失，神经纤维层变薄，临床检测视功能的损害往往先于患者自觉症状出现之前。目前治疗以全身抗艾治疗结合局部手术治疗为主，I临床疗效不

3、理想，尽管学者们公认AIDS视网膜病的发病基础是HIV造成的血一视网膜屏障(Blood—RetinaBarrier，BRB)崩溃，但其具体发病机理并不明确，对AIDS视网膜病发病机制的探索将有利于临床诊治工作的有效开展。HIV-I包膜蛋白gpl20在病毒对宿主细胞的侵犯机制中的作用已有大量文献报道。首先，病毒表面的结合态gpl20在介导HIV对宿主细胞的结合中具有关键作用，其次，自感染细胞释放的游离态gpl20的细胞毒性同样不容忽视。如gpl20诱导细胞氧化应激，促进炎症介质释放、细胞凋亡，细胞间

4、紧密连接破坏等等。在视网膜疾病的研究中，视网膜色素上皮细胞(RetinaPigmentEpithelialCell，RPE)具有重要地位。RPE及其细胞间紧密连接不但形成基底膜-Brush膜一脉络膜复合体，参与构成血一视网膜屏障，细胞内还含有多种抗氧化剂，包括水溶性代谢物和酶如酸性维生素C，脂溶性物质如维生素E、黑色素等，是抗氧化作用的重要场所。此外，RPE细HIV-!gpl20对视网膜色素上皮细胞功能影响及其分子机制的研究胞能特异性地吞噬感光细胞的外节段(OuterSegment，OS)，这对于

5、视细胞外节更新和正常视觉功能的维持具有重要意义。遗憾的是，国际上目前有关AIDS视网膜并发症的研究中，gpl20是否导致RPE细胞病理改变及其发病机制的报道相当缺乏。根据目前的研究结果，我们推测：gpl20对RPE细胞的影响可能在HIV对血一视网膜屏障的侵犯机制中起着重要作用。那么，在AIDS视网膜病的发生过程中，gpl20究竟是如何参与，发病机制是什么昵?在这个过程中，视网膜色素上皮细胞究竟发生了什么样的改变，这一过程是否是导致视网膜功能紊乱的原因呢?据此，本研究首次从分子水平探讨gpl20对R

6、PE细胞的功能影响及其作用环节，预期研究结果可能为眦V眼部感染的防治提供理论和实验依据。本课题从以下四个方面入手：一、gpl20体外对RPF．细胞增殖和凋亡的影响1．目的：探讨体外实验中gpl20对RPE细胞的生长增殖及凋亡的影响，以及细胞株D407有关CD4，CXCR4，CCR5受体表达的免疫化学特征。2．研究方法：2．1RPF．细胞的免疫化学特征培养RPE原代细胞与细胞株D407，用免疫组织化学的方法鉴定原代细胞角蛋白染色，以及细胞株D407有关CD4，CXCR4，CCR5的表达；2．2gpl

7、20对RPE细胞(原代和D407细胞株)增殖和凋亡的影响使用4—6代的原代细胞和D407细胞株，首先检测在96孔板不同密度种植的细胞第24小时的生长曲线，并选择3000细胞／孔为生长抑制实验的种植密度。用MTT法检测不同浓度的gpl20(分别为0、0．001、0．002、0．004、0．016、0．032、0．08、0．1、0．12、0．15IIg／m1)分别作用RPE细胞24tJ、时，48小时以及72tJ、时的生长率。使用流式细胞术检测经0．1IIg／ml的gpl20处理RPE细胞24、48和7

8、2小时后的凋亡率。2．3透射电镜观察gpl20对D-407细胞超微结构的影响采用透射电镜的方法，观察经O．111g／ml的gpl20处理后的D407细胞超微结构的影响。3．研究结果3．1D407细胞株免疫细胞染色CD4受体为阴性，CXCR4及CCR5受体为阳性，在细胞浆内和细胞膜上均有分布。。IIH[V-!gpl20对视网膜色素上皮细胞功能影响及其分子机制的研究3．2MTT细胞抑制实验和流式细胞仪凋亡率检测结果：第48，72d,时处理组自gpl20浓度0．004IJg／ml起，对R