dram1通过bax调节凋亡

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1、硕士学位论文论文题目DRAM1通过BAX调节凋亡研究生姓名孙玮指导教师姓名秦正红专业名称药理学研究方向神经药理论文提交日期2013年5月DRAM1通过BAX调节凋亡中文摘要DRAM1通过BAX调节凋亡中文摘要目的：研究细胞死亡过程中DRAM1对BAX的调节及DRAM1通过BAX参与凋亡的分子机制方法：(1)构建DRAM1过表达模型，Westernblot法测定DRAM1对BAX蛋白水平的影响；检测DRAM1siRNA干扰所致的BAX水平的变化。(2)RT-PCR法检测DRAM1对BAXmRNA的影响。(3)使用泛素-蛋白酶体途径抑制剂、自噬-溶酶体途径抑制剂或干扰ATG5以

2、抑制自噬后，观察BAX水平的变化以确定BAX的降解方式。(4)使用自噬的激动剂激活自噬后，观察BAX的降解情况。(5)构建DRAM1过表达模型后使用自噬-溶酶体途径抑制剂，观察DRAM1对BAX降解的影响。使用蛋白质合成抑制剂检测DRAM1对BAX半衰期的影响(6)co-IP试验，GST-pulldown观察DRAM1和BAX的结合情况。(7)免疫细胞化学法检测3-NP对BAX溶酶体亚细胞定位的影响，分离溶酶体后Westernblot法测定BAX蛋白的溶酶体亚细胞定位以及BAX定位于溶酶体后对溶酶体稳定性的影响。(8)Westernblot法观察BAX的RNA干扰对3-NP

3、诱导的BID的剪切、细胞色素C的释放以及caspase-3激活情况的影响。结果：本实验成功的建立了DRAM1过表达的细胞模型。Westernblot结果显示DRAM1过表后BAX的蛋白水平上调；而干扰DRAM1可以抑制表阿霉素所引起的BAX水平的上调。RT-PCR的结果显示过表达DRAM1并不能上调BAX的mRNA水平。Westernblot结果显示抑制泛素-蛋白酶体途径后BAX蛋白并没有出现累积，而自噬-溶酶体途径抑制剂或ATG5的RNA干扰可以上调BAX的蛋白水平。在使用雷帕霉素激活自噬后，由于此时雷帕霉素引起了DRAM1水平的升高，BAX的蛋白水平也随之升高；而在干扰

4、DRAM1的前提下激活自噬可以加速BAX蛋白的降解。质粒转染法构造DRAM1过表达模型后再使用自噬-溶酶体途径抑制剂，BAX的蛋白水平并没有出现进一步的升高；半衰期实验结果显示DRAM1过表达的细胞系，其BAX蛋白的半衰期长于正常细胞系。co-IP和GST-pulldown结果显示DRAM1可以与BAX发生相互作用；免疫细胞化学和分离溶酶体的结果同时显示了DRAM1可以招募BAXI中文摘要DRAM1通过BAX调节凋亡至溶酶体并且定位于溶酶体的BAX可以释放溶酶体酶Cathepsin-B。BAX的RNA干扰实验显示BAX参与了BID的剪切、细胞色素C的释放以及caspase-

5、3激活。结论：DRAM1可以上调BAX的蛋白水平，但DRAM1并不能影响BAX的mRNA水平；BAX可经自噬-溶酶体途径降解，而DRAM1可以阻碍BAX的降解并延长BAX蛋白的半衰期；DRAM1可以与BAX发生相互作用并招募BAX至溶酶体并形成通道释放溶酶体酶Cathepsin-B；释放到胞质中的Cathepsin-B剪切BID，tBID募集向线粒体诱发凋亡的发生。关键词：DRAM1；BAX；自噬；调亡作者：孙玮指导教师：秦正红教授IIDRAM1regulateapoptosisthroughBAXAbstactDRAM1regulateapoptosisthroughBA

6、XAbstactAim：ToinvestigatedifDRAM1canpromoteapoptosisviaupregulationofBAX.Methods:(1)ToevaluatewhethertheelevationofBAXwasregulatedbyDRAM1,cellsweretreatedwithDoxorubicinwithorwithnotDRAM1siRNA.CellswerealsotransfectedwithDRAM1-pCDNA4.(2)RT-PCRamplificationwasusedtotestifBAXupregulationwasd

7、ependentoftranscription.(3)ToexaminethefateofBAX,cellsweretreatedwithUbiquitin-proteasomepathwayinhibitororautophagy-lysosomepathwayinhibitor.TheeffectsofATG5siRNAonBAXproteinlevelwasalsotested.(4)TofurtherconfirmthedegradationofBAX,A549cellsandA549-DRAM1RNAic