cd147与caml在恶性黑素瘤细胞中的相互作用研究

《cd147与caml在恶性黑素瘤细胞中的相互作用研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、中图分类号墅窆2：12UDC610博士学位论文学校代码!Q533密级公珏CDl47与CAML在恶性黑素瘤细胞中的相互作用研究CD147interactswithcalcium--modulatingcyclophilinligandinmelanomacellsligandelanomacells作者姓名：学科专业：研究方向：学院(系、所)：指导教师：副指导教师：龙婷婷临床医学八年制皮肤与性病学湘雅医院陈翔教授曾伟奇老师论文答辩日期丝：尘：丝答辩委员会主席中南大学二零一三年五月一令一二，牛血月原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，

2、除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：焦堡鸳日期：卫噍年上月丝日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务

3、。本课题由以下基金资助国家自然科学基金一国家杰出青年科学基金项目号：81225013负责人：陈翔国家自然科学基金一青年基金项目号：81201240负责人：曾伟奇项目号：81101193负责人：粟娟特此致谢!CDl47与CAML在恶性黑素瘤细胞中的相互作用研究摘要研究目的：CDl47是一种属于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白，本实验组前期研究表明CDl47能促进恶性黑素瘤侵袭、转移、增殖和血管新生，但具体机制还不十分清楚。钙离子信号调节亲环素配体(calcium．modulatingcyclophilinligand，CAML)是定位于线粒体的跨膜蛋白，能调节胞内钙离子浓度，本研究拟通过对CD

4、l47与CAML在恶性黑素瘤细胞株A375中相互作用的研究，明确其相互作用的位点，在细胞中的定位及对胞内钙离子的影响，为进一步揭示恶性黑素瘤发生发展的分子机制提供理论依据。研究方法：1．以CDl47为诱饵，运用酵母双杂交技术筛选人胚脑细胞文库，以寻求与其相互作用的蛋白。2．构建CAML与CDl47全长及缺失突变体的真核表达载体。3．运用免疫共沉淀(co．IP)验证CDl47与CAML相互结合，同时共转染CAML质粒及CDl47的不同缺失突变体质粒至工具细胞293T，CO．IP分析CDl47与CAML相互结合的位点。4．运用细胞免疫荧光方法观察A375细胞中CDl47与CAML的定位，同时

5、在A375细胞中共转染CAML及CDl47的不同缺失突变体质粒，检测不同区段对定位的影响。5．合成CDl47的小分子干扰RNA(smallinterferingRNA，iRNA)片段，利用该片段在A375细胞中敲降CDl47并检测敲降效率。6．运用Fluo．4，AM探针观察CDl47敲降对A375细胞内静息钙离子浓度的影响，以及毒胡萝卜素(thapsigargin，TG)抑制内质网钙离子ATP酶(Sarco／EndoplasmicreticulumCa2+_ATPase，SERCA)后对胞内钙离子流动的影响。7．运用佛波酯(phorbol12．myristate13一acetate，PM

6、A)和TG上升A375细胞胞内钙离子，检测基质金属蛋白酶9(matrixmetalloproteinase9，lVIMP．9)的表达水平，同时检测CD147敲降的A375细胞在上述两种药物作用后的MMP．9表达水平的变化。研究结果：1．酵母双杂交筛选出CAML与CDl47相互作用。2．成功构建了CAML与CDl47全长及缺失突变体的真核表达载体。3．Co．IP验证CAML与CDl47相互作用的结果，并进一步证实CDl47与CAML相互结合的区段位于CDl47跨膜段。4．细胞免疫荧光发现A375细胞中CDl47与CAML在内质网存在共定位现象，缺失跨膜及膜内段的CDl47突变体与CAML几

7、乎不存在共定位。5．成功设计并应用两个CDl47siRNA片段，以无特异性siRNA序列为对照组。6．CDl47敲降的A375细胞内静息钙离子浓度及TG刺激胞浆内钙离子上升幅度均低于对照组。7．PMA及TG上升胞内钙离子后能诱导MMP．9的表达增加，而敲降CDl47则能显著抑制钙离子对MMP一9的诱导效应。结论1．CDl47与CAML相互结合，结合域位于CDl47跨膜段；2．恶性黑素瘤细胞中CDl47与CAML在内质网中存在共定位现