基于est模型的全氟烷基化合物致心肌发育毒性作用及其定量蛋白质组学研究

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1、浙江大学硕士学位论文基于EST模型的全氟烷基化合物致心肌发育毒性作用及其定量蛋白质组学研究姓名：张莹莹申请学位级别：硕士专业：药理学指导教师：朱丹雁2013-03-01浙江大学硕士学位论文中文摘要基于EST模型的全氟烷基化合物致心肌发育毒性作用及其定量蛋白质组学研究浙江大学药学院药理学专业10级硕士研究生张莹莹导师朱丹雁副教授摘要胚胎干细胞测试(embryoIlicstemceUtest，EST)体系以胚胎干细胞(embryoIlicstemcell’Escell)分化为心肌细胞模型为基础，是欧洲代替方法验证中心(theEuropeaIlCenterforthe

2、ValidationofAltemativeMethods，ECⅥ、M)提出的作为体外筛选和评价受试物(包括药物或环境中化合物等)可能具有的发育毒性手段。该体系能基本模拟乃至重现体内心肌分化和发育复杂全程，富含大量心肌发育依赖性生物信息，与体内毒性实验相比，具有对药物作用反应迅速、干扰因素少、敏感性高等优点。全氟烷基化合物(P01ynuorillatedAlkylsubstances，PFAs)被广泛应用于工业生产和人类消费，包括金氟辛烷磺酸(PernuorooctalleSulf011ate，PFOS)，全氟辛酸(PernuorooctanoicAcid，PF

3、OA)，全氟丁基磺酸(Pemuorobutanesulfollate，PFBs)等。该类化合物大量使用致使其以各种途径进入全球范围内各种环境介质如水体、土壤、大气中，并通过食物链传递放大生物效应，目前在人体以及许多动物组织中均发现浓度较高PFos和PFoA存在。这类化合物在自然环境和生物体内具不分解性和很高的生物积累能力，其所造成的全球性生态污染已成事实，Ⅱ浙江大学硕士学位论文中文摘要这是直接关系到人类健康的重要问题。已有文献报道PFOS具有发育毒性、生殖毒性、心血管毒性、神经毒性等多重毒性效应，被认为是一类具有全身多脏器毒性化合物。虽然研究者已经掌握了一些关于

4、PFOs发育毒理学研究资料，但还处于初始阶段，且多限于动物实验。PFOS引起的发育毒性作用机制和敏感指标还远未完全清楚。氨基酸进行稳定同位素标记(stableIsotopeLabel洒gwithAminoAcidsillceucuhures，sILAc)是近年来发展起来的比较蛋白组学新方法，可以对低丰度蛋白质直接捕获和快速定性、定量鉴定分析，快速找出重要功能蛋白质。目前尚未见利用EsT系统预测全氟烷基化合物对心肌发育毒性作用研究报道，也未见利用sILAc标记定量蛋白质组学技术研究该类化合物毒性作用机制，亟待深入探索加以论证。基于上述背景，本学位论文主要利用EST

5、模型从细胞毒性、分化抑制、基因蛋白表达不同水平系统论证全氟烷基系列化合物PFos、PFoA和PFBs心肌发育毒性作用强弱等级及构效关系。为进一步重点考察PFos对心肌发育毒性作用的具体分子机制，我们采用sILAc标记的蛋白组学方法定量研究PF0s干预ES细胞定向分化心肌细胞前后差异表达蛋白图谱。采用GO分类方法探讨差异蛋白的细胞位置、基因参与的生物过程、发挥的分子功能，通过Pathway分析PFoS对不同通路的影响，通过Ne咖rk分析差异基因的网络互作关系，并采用w，estemBlot法对差异蛋白予以验证。研究结果将有利于揭示PFos引起心肌发育毒性作用的早期分

6、子事件和毒性敏感指标。同时有利于将EsT作为一种有效的毒性评价体系在化合物成药性或环境毒物对心肌毒性预测性评估中的推广应用。目的：利用EsT模型从细胞毒性、分化抑制、基因蛋白表达不同水平评价全氟烷基化合物PFoS、PFoA和PFBS对小鼠胚胎干(MouseElnbryonicSteIIl'mES)细胞定向分化为心肌细胞的发育毒性作用，分析该类化合物致心肌发育毒性的构效关系。并利用sILAc标记的定量蛋白质组学探讨PFos致心肌发育毒性作用机制。IⅡ浙江大学硕士学位论文中文摘要方法：利用经典的悬滴培养法建立EsT模型，加入不同浓度的青霉素、DPH、5．Fu以及全氟

7、烷基化合物PFOS、PFOA和PFBS，检测受试物对mES定向心肌分化能力的影响获得产生50％n1ES细胞分化抑制作用的浓度ID50D3；采用mT法检测受试物对Es细胞和3T3细胞的细胞毒性获得产生50％细胞毒性作用的浓度Ic50D3和Ic503T3，经发育毒性计算公式计算，并依据发育毒性判定标准评定受试物的发育毒性等级，并分析全氟烷基化合物致心肌发育毒性构效关系。利用SILAC定量蛋白质组学技术考察PFOS干预ES细胞定向分化心肌细胞前后差异表达蛋白图谱，分别用含轻型稳定同位素(天然稳定同位素)和重型稳定同位素标记必需氨基酸的培养基，对mEs分别进行培养，待细

8、胞标记完全后(标记率90