鸡尾酒疗法作用肝星状细胞的定量蛋白质组学研究

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1、分类号』UDC硕士学位论文鸡尾酒疗法作用肝星状细胞的定量蛋白质组学研究论文答辩日期朱敏学科专业动物萱差皇绳料型堂指导教师圭趟里2013．05．28学位授予El期——一=．二。：广西大学学位论文原创性和使用授权声明／㈣炒本人声明所呈交的论文，是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得广西大学或其它单位的学位而使用过的材料。与我一同工作的同事对本论文的研究工作所做的贡献均已在论文中作了明确说明。本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归属广西大

2、学。本人授权广西大学拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权保存并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。本学位论文属于：口保密，在年解密后适用授权。，叼不保密。(请在以上相应方框内打“√”)论文作者签名：指导教师签名：作者联系电话：华锹幸携名15078856713日期：矽f≥，占．口日期&。呱为。77电子邮箱：495731956@qq．com鸡尾酒疗法作用肝星状细胞的定量蛋白质组学研究摘要背景：肝纤维化是由各种致病因子所引起的组织修

3、复过程，主要表现为细胞外基质在肝脏内过度沉积，它是肝硬化乃至肝癌共同的病理基础。因此，探寻有效治疗肝纤维化的方法是非常必要和迫切的。近年来，许多研究证实肝纤维化是可以逆转的，对抗肝纤维化药物的研究也取得了一定的进展，但肝纤维化发生机制复杂，而着眼于阻断发病机制某一环节的药物治疗见效不大。本研究小组前期应用表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、牛磺酸(Taurine)和三羟基异黄酮(Genistein)三种具有不同抗纤维化作用机理的药物联合组成鸡尾酒(Cocktail)进行了一系列体内外实验，发现其具有抗肝纤维化作用。目的：本研究运用iTRAO．技术结合高效液相色谱一电喷雾串

4、联质谱(LC—ESI．MS／MS)的定量蛋白质组学方法，研究鸡尾酒作用肝星状细胞株HSC—T6后，细胞的整体蛋白表达水平发生的变化，分析和鉴定细胞中差异表达的蛋白质，从蛋白质水平探讨鸡尾酒疗法抗肝纤维化的作用机理，以期为肝纤维化的诊断、治疗和预后寻找可靠的生物标志物。方法：以HSC．T6作为靶细胞，经Cocktail作用后，采用M丌法测定药物对细胞增殖的影响，确定Cocktail对HSC．T6增殖抑制的最佳浓度；然后提取Cocktail最佳浓度作用下肝星状细胞株HSC—T6的细胞总蛋白，用bradford法定量蛋白质浓度；取等量蛋白用胰蛋白酶(Trypsin)酶解，再以同位

5、素标签的iTRAQ标记蛋白质肽段，经阳离子柱(scx)分离后，利用Lc—ESI—MS／MS进行质谱检测差异表达的蛋白质，后采用Mascot进行IPI大鼠蛋白数据库搜索鉴定蛋白质，运用生物信息学分析差异表达的蛋白质功能。结果：(1)鸡尾酒疗法对HSC—T6增殖有抑制作用，cocktail低、中、高剂量组与对照组的A值比较有显著性差异(0．122_+0．009，o．154+0．016，0．187+0．052VS0．223+0．032，Po．05)，低剂量、中剂量与高剂量组间有显著差异(P

6、蛋白质。根据当蛋白丰度差异倍数达到1．2倍以上，且经统计检验其p-value值小于o．05时，视为差异蛋白。与对照组相比，三次生物学重复鉴定到的差异蛋白数量分别：第一次实验共发现285种差异表达的蛋白质，其中119种蛋白质上调，166种蛋白质下调；第二次重复实验时共找到331种差异表达蛋白质，其中126种蛋白质上调，205种蛋白质下调；第三次重复实验时发现330种差异表达蛋白质，130种蛋白质上调，200种蛋白质下调。经过分析发现，三次生物学重复均鉴定到的差异蛋白为36个，其中表达上调的差异蛋白有11个，表达下调的差异蛋白有25个。通过对这些差异蛋白进行蛋白质功能分析，发现

7、其参与翻译后修饰、转录、重组和信号传导通路等过程。结论：(1)鸡尾酒疗法具有抑制HSC．T6增殖的作用，Cocktail低剂量组(taurine15pg／ml+EGCG17．5岭／ml+genistein3．51xg／m1)具有较好的抑制作用；(2)丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶、基质金属蛋白酶抑制剂1、半乳糖凝集素．3结合蛋白、纤溶酶原激活物抑制剂1、层粘连蛋白等可能参与Cocktail对HSC．T6的抗纤维化作用；(3)半乳糖凝集素．3结合蛋白、纤溶酶原激活物抑制剂1可作为肝纤维化早期诊断候选标志物。(4)鸡尾酒疗法的