十二指肠钩虫锰超氧化物岐化酶(admn-sod)生物信息学的分析、表达及其活性的研究

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1、十二指肠钩虫锰超氧化物岐化酶(AdMn．SoD)的生物信息学分析、表达及其活性研究摘要【目的】本论文在课题组前期分离获得十二指肠钩虫锰超氧化物岐化酶(AdMn．SOD)基因序列的基础上，对推导的AdMn．SOD氨基酸序列进行生物信息学分析；进一步构建AdMn．SOD成熟蛋白原核表达系统，在大肠杆菌(E．cD厅)中融合表达A舐缸．SOD，并分析纯化的重组AdMn．SOD的活性及温度、pH值对活性的影响。研究结果将为进一步研究AdMn．SoD的生物学功能并探讨其应用奠定基础。【方法】1．AdMn-SOD的生物信息学分析运用生物信息学软件DNAS吖皿及DN触以AN分析前期获

2、得的AmI．SOD基因序列的阅读框(OI谭)；运用在线软件Si铲alIP3．0及TargetPprogramm却：／／mⅣw．cbs．dtll．dUse耐c鹤)分别预测推测的AdMn-SOD的信号肽序列及其亚细胞定位；运用在线生物信息学软件BLAST搜索An由叶SOD基因序列及其推导的氨基酸序列在GcIlBaIlk(h卸：价m啊．n曲i．nllll．11ih．90帕中的同源性序列；在Ⅵ啊w．exp硒y．ch厂I的ls／l，呻锄吼．h衄l中分析推测的An函n．SoD理化性质；在h婶：／／npsa-pbil．ibcp．丘上选用m呵N法对推测的A．dMn·SOD的二级结构和

3、折叠类型进行预测；在http：／／们刑．ebi．∞．1ll【厂r幻1讥nterpmSCIAN／中搜索推测的AdMn．SOD的功能域；运用CUJSTALW程序比对分析An缸．SOD与其它已报道线虫及部分代表性物种的Mn．SOD氨基酸序列；运用MEGA3．1软件中邻近法(I溉gll_bor-joiningm砒0d)分析基于Mn—SOD氨基酸序列的AdMn—SoD与其它线虫及部分代表性物种Mn．SOD的进化树关系。2．AdMn-SOD的原核表达设计引物，扩增Ad№．SOD成熟蛋白编码序列，扩增产物经MI和Z砌饥II双酶切后与表达载体pET．32a连接，构建重组原核表达重组质

4、粒。将构建好的重组表达质粒pET-32砒犍Mn-SOD转化至大肠杆菌BL2l(DE3)，经PTG诱导表达，SDS．PAGE分析表达情况。3．重组AdMn-SOD的活性检测诱导表达的重组蛋白用Ni亲和层析进行纯化，用Bradf．0rd法测定纯化蛋白的浓度，用超氧化物岐化酶检测试剂盒wsT-l检测重组蛋白AdMn．SOD的超氧化物抑制百分率，测定其酶活性的单位，并分析温度、pH值对活性的影响。【结果】1．AdMn．SOD的生物信息学分析推导AdMn-SODcDINA完整OI江为648bp，编码216个氨基酸残基组成的多肽。AdMn．SOD包含有保守的与锰离子结合的3个组氨

5、酸残基及1个天冬氨酸残基(His-46，His．94，Asp-178，His—182)，具有Mn·SOD具有的“D'啪HAYY"保守结构。AI舭卜SOD前端20个氨基酸残基组成信号肽序列，第2l一216个氨基酸序列为其蛋白序列；经用Targ卯预测，AdMn．SOD位于线粒体中。用BLASTN及BLASTP程序在GellBank中检索相似性序列，结果显示Ad№．sOD基因序列及其推导的编码蛋白与秀丽小杆线虫、罗氏沼虾Ⅲ删砒幽f删脚明6孵的及中国对虾(砌刀e唧册口邮幽加伽话)等线粒体M小SOD具有较高相似性。与其它线虫及部分代表性物种的Mn．SOD氨基酸序列比较及进化树研

6、究表明，AdMn．SoD具有Mn．SOD的保守结构，且与线虫Mn-SOD亲缘关系较近。2．AdMn-SOD的原核表达运用RPPCR技术扩增获得了AdMn-SOD的成熟蛋白编码序列，并成功构建了pET32a／Ad№．SOD原核表达重组质粒。构建好的重组表达质粒pET-32以dh恤．SOD转化至大肠杆菌BL21(DE3)后，口TG能诱导目的蛋白AdMn．SOD在大肠杆菌BL21(DE3)中高效地可溶性表达。优化条件下可获纯化的重组AdMnSOD可溶性目的融合蛋白量达44．4nlg／IIll。3．重组AdMn．SOD的活性检测纯化的重组AdMn．SOD活性(抑制率％)为95

7、．5，酶活性单位为3169u／mg。pH值在6．5和9．5之间对其活性影响不大，其最适pH为8．5；随温度的升高，其活性逐渐降低，在90℃仍存在40％以上活性，因此可知重组AdMn．SOD对温度有较好的耐受性，在较高温度仍具有较好的酶活。2【结论】经生物信息学分析，AdMn-SOD具有典型Mn-SOD的结构特征，与线虫Mn．SOD亲缘关系较近，与其他生物种Mn．SOD序列也具有较高相似性；成功构建了pET32以dMn．SOD原核表达重组质粒，表达了Aml．SOD，重组AdMn．SOD具有较好生物活性，结果为进一步研究AdMn．SOD的生物性功能和特性